3 курс / Общая хирургия и оперативная хирургия / Мельцова_А_Ж_Использование_аллогенных_фибробластов_в_комплексном

51

добавок. Ростовая питательная среда состоит из 90% (по объёму) химически составленной среды и 10% сыворотки крупного рогатого скота или других видов животных, с добавлением антибиотиков и специфических ростовых добавок. В Отделе клеточных культур Института цитологии РАН используется питательная среда: для культивирования нормальных фибробластов кожи человека DMEM (фирма ICN) с добавлением антибиотика гентамицина и сыворотки эмбрионов коров. Обязательной добавкой является фенолфталеин для идентификации рН среды. Оптимальное значение рН 7.2–7.4. Дермальные ФБ кожи человека культивируются на чашках Петри и/или в культуральных флаконах и в норме через 5 суток культивирования образуют монослой. Для культивирования ДФЧ используется питательная среда DMEM (фирма ICN) + 10% v/v FBS (фирма Hy Clone) (эмбриональная сыворотка крупного рогатого скота) + антибиотик гентамицин (используется для предотвращения контаминации микробами). При пересеве клеток используется смесь растворов ферментов: трипсина и версена, в соотношении 1:1.

2) Пересев клеток (пассирование).

1.Предварительно до 37о С нагревается культуральная среда, раствор ферментов (трипсин-версен). В ламинар приносится новая посуда для пересева и флаконы с культурой клеток.

2.Стерильной пипеткой из культуральных сосудов удаляется израсходованная в процессе жизнедеятельности клеток среда.

3.Флакон несколько раз промывается небольшим количеством раствора ферментов для удаления остатков среды, содержащей сыворотку, которая нейтрализует действие фермента.

4.Добавляется 0,5-1 мл раствора фермента, который будет действовать на клеточные рецепторы, гидролизуя их, что приводит к откреплению клеток от поверхности культурального сосуда.

5.Культуральные флаконы помещают в термостат на 2-5 минут при 37° С, поскольку оптимальное действие фермента происходит при 37° С.

52

6.Результат действия фермента контролируется каждые 1-2 минуты при помощи светового микроскопа.

7.В процессе инкубации распластанные клетки округляются и начинают открепляться. Во флакон необходимо добавить 2-3 мл новой среды, содержащей сыворотку, для предупреждения повреждение клеток.

8.Когда большинство клеток округлилось активным пипетированием, клетки сбивают со дна культурального флакона и переносят во временную ёмкость для дальнейшего подсчёта количества клеток.

9.Суспензию клеток переносят на новые культуральные флаконы с необходимой плотностью.

При смене среды пипеткой из чашки Петри и/или культурального флакона удаляется израсходованная в процессе жизнедеятельности клеток среда. После чего добавляется необходимый объём свежей среды.

3) Получение коллагена I типа.

При получении коллагена используют сухожилия из хвостов крыс. Сухожилия вытягивают и механически измельчают для упрощения последующего процесса экстракции коллагена. Измельчённые сухожилия экстрагируют уксусной кислотой при непрерывном перемешивании в течение 12-15 часов. Затем производят центрифугирование и осаждение коллагена NaCl. Не осажденную фракцию удаляют. Для удаления остатков уксусной кислоты и фосфатов проводят последовательный диализ против уксусной кислоты и фосфатов. После выполнения этих процедур коллаген остаётся в виде геля. Чистоту коллагена определяют методом электрофореза.

4) Непосредственное приготовление ДЭ на основе коллагена с использованием дермальных фибробластов человека.

Для приготовления дермального эквивалента нами используется коллаген I типа. После разведения коллагена до заданной концентрации и подведения уровня pH до нейтрального в него добавляется суспензия ФБ. Все манипуляции производятся на льду, так как при комнатной температуре коллаген быстро полимеризуется. С помощью пипетирования ФБ равномерно распределяются в

53

коллагене, после чего полученная суспензия переносится в стерильные чашки Петри. ДЭ культивируется от нескольких часов до нескольких дней. Результатом является комплексный продукт — ДЭ, включающий живые клетки ФБ человека и основной компонент внеклеточного матрикса — коллаген (рис. 1).

Рис.1. Дермальные ФБ в коллагеновом геле. (Микрофотография Х

1000)

2.4.2. Методика экспериментального исследования влияния дермального эквивалента на течение раневого процесса

С целью изучения влияния аллогенных дермальных ФБ в коллагеновом геле на процессы заживления ран было выполнено экспериментальное исследование на крысах. В экперименте были использованы крысы линии Wister, самцы массой 180-200 грамм. В эксперимент было включено 45 животных. Экспериментальное исследование проводилось на базе НИЦ ГОУ ВПО «СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова Росздрава». У животных создавалась, выполненная по оригинальной методике, экспериментальная модель длительно незаживающей кожной раны.

В условиях операционной, после предварительного сбривания шерсти и обработки спины крысы раствором йода, под ингаляционным наркозом парами эфира в сочетании с внутривенной анестезией тиопенталом натрия, проводилось оперативное вмешательство (рис. 2).

54

Рис. 2. Предоперационная обработка операционного поля.

Острым путем (скальпелем) иссекался полнослойный кожный лоскут по вертебральной линии спины крысы, ближе к шейному отделу. Производилось иссечение кожи и подкожной клетчатки до фасции, с формированием раны диаметром 3,5 см. Для предотвращения контракции раны и отграничения краевой эпителизации по периметру раны подшивали полихлорвиниловое кольцо диаметром 3,5 см. Кольцо фиксировали к краям раны 5-8 узловыми швами на всю толщину кожи (рис.3). В центр дна раны узловым швом подшивали аутодермотрансплантат для оценки процесса эпителизации.

а) б)

Рис.3. Формирование экспериментальной раны: а — нанесена полнослойная кожная рана; б — подшито ограничительное кольцо

55

В зависимости от методики применяемой для заживления экспериментальных ран, животные были разделены на две группы – основную (30 животных) и контрольную (15 животных). В дно раны животным основной группы пересаживали аллогенные дермальные фибробласты в коллагеновом геле, приготовленные по описанной методике (рис. 4). Раны у животных контрольной группы оставляли без воздействия лечебными препаратами.

Рис. 4. Пересадка ДЭ в дно экспериментальной раны

Над кольцом фиксировали защищающую рану асептическую марлевую повязку (рис. 5). Животных рассаживали по одному или малыми группами для предотвращения нарушения целостности повязки.

Рис. 5. Формирование защитной асептической повязки над раной

56

Для оценки биохимического состава ГТ на 4-е сутки из раны выполнялось взятие микробиоптата, без выведения животных из опыта. Биохимические исследования выполнены на базе кафедры биохимии СанктПетербургского Государственного Университета. Всего изучено 10 проб грануляционной ткани, взятой у экспериментальных животных (5 — основная группа, 5 — контрольная). Биоптат замораживали в морозильной камере. Транспортировку осуществляли в охлажденном состоянии в сосудах Дюара.

Для определения количественного состава нуклеиновых кислот образцы гомогенизировали в растворе 0,3 М КОН и инкубировали 1 час при t = +37°С для щелочного гидролиза РНК. К гидролизату добавляли 1N HClO4 до концентрации 0,2 N. Кислотно-нерастворимый материал (белки, ДНК) удаляли центрифугированием (3000 g, 20 мин). Измеряли оптическую плотность раствора олигонуклеотидов РНК при длине волны 260 и 284 нм. Концентрацию РНК рассчитывали по формуле:

(ДО260 – ДО284) х 75 = мг РНК в 1 мл измеряемого раствора.

К кислотно-нерастворимому материалу добавляли 1N HClO4 и вели гидролиз ДНК (95° С, 30 мин). Кислотность гидролизата снижали добавлением раствора КОН (до 0,2 N по HClO4) и пробы центрифугировали (3000 g, 20 мин). Измеряли оптическую плотность (ДО) супернатантного раствора при длине волн 268 и 283 нм.

Концентрацию ДНК в кислотном гидролизате рассчитывали по формуле: (ДО268 – ДО283) х 93 = мкг ДНК в 1 мл измеряемого раствора.

Определяли соотношение РНК и ДНК в пробах.

Определение содержания аминокислот в гомогенатах тканей проводили методом микроколоночной высокоэффективной хроматографии на приборе ХЖ-1311 в режиме обращенно-фазового градиентного элюирования, в тех же образцах ГТ. Аминокислоты анализировали в виде их дансильных производных на фторопластовой микроколонке 300 х 0,5 мм I.D., упакованной сорбентом Nucleosil-SC 18. Градиент линейно-ступенчатый ацетонитрила в Naформалиновом буфере. Время полного анализа 1 час.

57

Сроки наблюдения животных в эксперименте составили 6, 9 и 14 суток. При достижении указанных сроков проводили выведение 10 животных основной группы и 5 животных контрольной группы. Эвтаназия животных проводились под ингаляционным эфирным наркозом, в сочетании с внутривенной анестезией тиопенталом натрия. Выполнялось взятие биоптата дна кожной раны — иссекалось дно раны, на всю толщу, до фасции. Проводилась фиксация 10% формалином. В дальнейшем проводилась заливка биоптатов парафином и изготовлялись срезы в направлении, перпендикулярном поверхности раны. Препараты окрашивались по стандартным методикам гемотоксилин-эозином и по методике Ван Гизона с красителем Вейгарта.

Для оценки гистологической структуры срезов проводилась световая микроскопия, микроскоп «АУ-12», ЛОМО (микроскопия с увеличением 160, 240). Изучалась зона краевой эпителизации кожного аутотрансплантата, оценивалась структура новообразованного эпидермиса, его протяженность с помощью окулярной вставки — микрометрической линейки. Для оценки структуры ГТ проводились морфометрические исследования, с использованием окулярной вставки в виде сетки. Исследованию подвергали ГТ препаратов, полученных из биоптатов на 6-е и 9-е сутки наблюдения. В каждом препарате морфометрия производилась в 5 полях зрения. В каждом поле зрения проводили подсчет лимфоцитов, лейкоцитов, плазматических клеток, макрофагов, фибробластов и кровеносных сосудов. По данным морфометрии были построены вариационные ряды.

2.4.3. Применение дермального эквивалента у больных в лечении трофических язв венозной этиологии

Пересадка ДЭ на язвенный дефект выполнялась в клиниках, в асептических условиях перевязочной. Транспортировка клеточных культур производилась в герметичных чашках Петри, в сосуде Дюара, с поддержанием температуры 15о С, в максимально щадящем для клеточных культур режиме, исключающем механическое и термическое воздействие. Непосредственно

58

транспортировка осуществлялась в день трансплантации, время до момента пересадки дермального эквивалента на язвенный дефект не составляла более 5 часов.

Пересадка проводилась больным с язвенным дефектом в стадии репарации. Для проведения успешной пересадки и предотвращения гибели аллогенных фибробластов необходимо соответствующее состояние язвенного дефекта, в частности, соблюдение следующих условий:

-отсутствие явлений острого воспаления, гнойного отделяемого

-отсутствие явлений выраженной экссудации и кровотечения, что препятствует адгезии культуральных клеток

-минимальная микробная обсемененность, т.к. в присутствии бактериальной инфекции возникает лизис дермального эквивалента (Парамонов Б.А., 2000);

-отсутствие некротически измененных тканей в дне язвенного дефекта;

-отсутствие фибриновых и других налетов;

-наличие в дне ТЯ ГТ Для обеспечения необходимых условий для приживления аллогенных

фибробластов, 30% больных основной группы проводилась предварительная подготовка. Проведение подготовки чаще (в 65% случаев) осуществлялось в амбулаторных условиях. Выполнялись регулярные перевязки с обработкой язвенного дефекта растворами антисептиков (хлоргексидин, диоксидин, фурацилин), очищение язвы ферментными препаратами (трипсин), применение водорастворимых мазей с осмотической активностью (левомиколь, левосин). Таким образом, применялась местная терапия, традиционно используемая в фазу экссудации, направленная на уменьшение воспалительных явлений и перевод язвенного дефекта в следующую стадию раневого процесса. Критериями подготовки язвенного дефекта к пересадке дермального эквивалента, кроме купирования проявлений острого воспаления и экссудации, являлось снижение микробной обсемененности ниже уровня 105 микробных тел на 1 г ткани (исследование микробной обсемененности производилось на предшествующем пересадке ДЭ этапе).

59

Непосредственно пересадка осуществлялась в перевязочной, в асептических условиях. Пациенты находились в горизонтальном положении, лежа на спине, положение конечности определялось необходимостью горизонтального расположения дна ТЯ. После снятия повязки язвенный дефект обрабатывался стерильным изотоническим раствором (NaCl 0,9%). Применение других лекарственных средств не в день пересадки, не в последующем периоде не допускалось, в связи с высокой чувствительностью культивированных клеток к химическому воздействию.

ДЭ макроскопически это прозрачный, не структурный гель розового цвета, без включений. Площадь ДЭ определяется площадью лабораторной посуды в которую он был помещен, до полимеризации коллагена. Толщина ДЭ составляет 1,8-2,0 мм. Нами были использованы ДЭ исходной площадью 3, 5 и 10 см3. Площадь необходимого для пересадки ДЭ определялась соответстветственно размерами язвенного дефекта. Моделирование формы эквивалента в соответствии с формой ТЯ проводилось непосредственно после переноса на дефект. ДЭ с помощью деревянного стерильного шпателя переносился из чашки Петри на язвенный дефект. Обязательным условием считалось покрытие всей площади ГТ в дне язвенного дефекта коллагеновым гелем с аллогенными фибробластами (рис. 6).

а) б)

Рис. 6. Пересадка ДЭ на ТЯ: а — трофический дефект подготовлен к пересадке, рядом расположена культуральная чашка с ДЭ; б — ДЭ перемещен на язвенный дефект

60

В дальнейшем, после пересадки ДЭ, ведении ТЯ соблюдались следующие условия:

-сохранение местоположения геля на язвенном дефекте, препятствие его смещению;

-отсутствие соприкосновения поверхности геля с повязкой, для предотвращения адгезии дермального эквивалента и повязки;

-поддержание влажной среды вокруг пересаженных клеток, для предотвращения высыхания дермального эквивалента.

Для обеспечения этих условий, после пересадки ДЭ, вокруг дефекта накладывался валик, препятствующий соприкосновению язвенной поверхности

иповязки. Валик изготовлялся из полихлорвиниловой полой трубки диаметром 12 мм, которой придавали форму кольца с диаметром, соответствующим длине язвенного дефекта. Вокруг трубки накладывали два слоя стерильного бинта. Валик укладывался вокруг язвенного дефекта, без соприкосновения с краями язвы. Поверх валика накладывалась стерильная марлевая салфетка, смоченная 0,9% раствором NaCl, а затем трехслойная асептическая марлевая повязка. Повязкой фиксировали валик, не допуская его смещения. Для предотвращения смещения ДЭ, больные соблюдали строгий постельный режим в течение 8 часов после пересадки, с ограничением движения нижней конечности. При этом сохраняли соответствующее положение нижней конечности, как и во время пересадки. В последующие двое суток больным рекомендовали ограничить двигательную активность.

Впервые сутки после пересадки ДЭ смачивали повязку над ТЯ 5 мл физиологического раствора каждые два часа, для предотвращения высыхания трансплантата. Первые сутки перевязки не производились, на вторые сутки производилась смена повязки с сохранением защитного валика. Обработка язвенной поверхности растворами антисептиков не производилась. В дальнейшем перевязки осуществлялись один раз за двое суток, в максимально щадящем для язвенного дефекта режиме, без дополнительного применения лекарственных препаратов.