2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Общая медицинская микробиология

Из полисахаридов в клетках откладываются гликоген, крахмал и крахмалоподобное вещество — гранулеза — специфический запасной полисахарид анаэробных споровых бактерий группы клостридий. Названные полисахариды построены из остатков глюкозы. В неблагоприятных условиях они используются в качестве источника углерода и энергии.

Липиды накапливаются в виде гранул, резко преломляющих свет и поэтому хорошо различимых в световой микроскоп. Запасным веществом такого рода является полимер β-оксимасляной кислоты, накапливающийся в клетках многих прокариот. У некоторых бактерий, окисляющих углеводороды, поли-β-окси- масляная кислота составляет до 70 % сухого вещества клеток. Отложение липидов в клетке происходит в условиях, когда среда богата источником углерода и бедна азотом. Липиды служат для клетки хорошим источником углерода и энергии.

Полифосфаты, содержащиеся в волютиновых гранулах, используются клетками как источник фосфора. Полифосфаты имеют макроэргические связи и являются депо энергии, хотя их роль как источника энергии незначительна.

Все запасные вещества представлены в виде высокомолекулярных полимерных молекул, в ряде случаев отграниченных от ЦП белковой мембраной, т. е. находятся в осмотически неактивном состоянии и нерастворимы в воде.

Включения — продукты клеточного метаболизма, имеющие приспособительное значение. Когда в этих веществах возникают потребности, они снова включаются в метаболизм.

Функции включений:

1. Трофическая: запасные вещества служат источником питательных веществ. Так, волютиновые гранулы коринебактерий дифтерии играют роль фос-

50

фатных депо, за счет которых клетка может при недостатке фосфора в среде осуществить еще несколько делений.

2.Энергетическая: запасные вещества служат источником энергии. Поэтому при отсутствии внешних источников энергии они могут продлить время существования клетки, а у спророобразующих видов — создать условия для образования спор.

3.Дифференциально-диагностическое значение у некоторых бактерий.

Например, зерна волютина обнаруживаются у возбудителя дифтерии (C. diphtheriae) и дифтероидов (C. xerosis, вызывающего конъюнктивиты, и C. ulcerans, вызывающего дифтериеподобные поражения кожи), но отсутствуют у непатогенных ложнодифтерийных палочек (C. pseudodiphtheriticum).

Выявление включений (зерен волютина). Волютин проявляет хромо-

фильность и метахромазию (имея щелочную реакцию, воспринимает кислые красители), легко выявляется в клетках в виде крупных гранул, особенно при специальных методах окраски. ЦП бактериальной клетки, обладая кислой реакцией, воспринимает щелочные красители. Исходя из этого, выявление включений осуществляется следующими способами:

1.Окраска по Леффлеру.

Техника окраски по Леффлеру:

– на фиксированный препарат наливают щелочной раствор метиленовой синьки на 3–5 мин;

– промывают водой, высушивают, наносят иммерсионное масло, микроскопируют: палочки (протоплазма) окрашиваются в светло-голубой цвет, зерна волютина (гранулы полифосфата) — в темно-синий (рис. 28).

2.Окраска по Нейссеру.

Техника окраски по Нейссеру:

– на фиксированный препарат наливают уксусно-кислую метиленовую синьку на 1–2 мин; краситель сливают, препарат промывают водой;

– наносят раствор Люголя на 30–60 с (иногда);

– промывают водой;

– докрашивают хризоидином 10–15 с или везувином 30 с – 3 мин;

– промывают водой, высушивают, микроскопируют: зерна волютина выявляются

удифтерийной палочки в виде интенсивно прокрашивающихся в темно-синий (без раствора Люголя) или черный (с раствором Люголя) цвет полюсов клетки; ЦП клетки окрашивается в нежно-желтый цвет (рис. 29).

3. Окраска волютина флюорохромом корифосфином: в люминесцентном микроскопе бактерии желто-зеленые, зерна волютина — оранжево-красные.

51

риальной клетки образуется только одна спора. У отдельных видов рода Clostridium обнаружены клетки с двумя и более спорами.

Объем споры в 10 раз меньше, чем вегетативной клетки. Структурно спора представляет ДНК, окруженную многослойной оболочкой (рис. 31).

Строение сердцевины спор сходно у разных видов. Объем оболочки споры достигает 50 % от всего объема споры. Строение оболочек спор у разных видов сильно различается. Оболочка определяет форму споры, защищает ее от действия литических ферментов и от преждевременного прорастания. Споры му-

тантных штаммов, лишенные оболочек, прорастают даже в неблагоприятной для роста среде, но проросшие клетки в такой среде погибают.

Рис. 31. Схематическое изображение строения споры:

1 — экзоспориум; 2 — слои споровой оболочки; 3 — внешняя мембрана споры; 4 — кортекс; 5 — внутренняя мембрана споры; 6 — сердцевина

Споруляция — процесс интенсивного распада белков материнской клетки с одновременным образованием новых белковых компонентов. Поэтому по антигенной структуре споры и вегетативные клетки одного и того же вида различны. Имеются также четкие различия между спорами разных видов. Процесс спорообразования генетически обусловлен. Он длится 18–20 ч, внешние источники питания и энергии не требуются.

Стадии спорообразования (споруляции):

1.Подготовительная. Перед спорообразованием резко снижается синтез ДНК и деление клеток прекращается. Происходит накопление большого количества запасного питательного вещества — гранулезы, откладывающегося в виде гранул. ЦП становится зернистой. Клетки резко увеличиваются в размерах, принимают вид лимона либо барабанной палочки, иногда клетки сохраняют обычную палочковидную форму.

У спорообразующей бактерии образуется дополнительный нуклеоид, который отходит к одному из полюсов клетки (рис. 32).

Вокруг дополнительного нуклеоида в ЦП спорообразующей клетки образуется спорогенная зона — уплотненный участок ЦП, не имеющий свободной воды.

2.Стадия предспоры (проспоры). В ЦПМ, ближе к одному из полюсов клетки, возникает инвагинация. В этом процессе участвуют мезосомы, которые спаивают сближающиеся участки инвагинированных мембран и образуют спо-

53

ровую перегородку (септу), разделяющую клетку на два протопласта, каждый из которых содержит одну хромосому (рис. 33).

Затем материнская клетка поглощает отсеченный участок ЦП с ядром (рис. 34). Это осуществляется путем роста и продвижения периферических участков мембраны материнской клетки по направлению к полюсу клетки. Эта стадия спорообразования обратима.

Если после образования септы добавить к спорулирующей культуре антибиотик левомицетин, то синтез белков и рост мембраны будет подавлен. Движение периферических участков мембраны, поглощающей отсеченный участок протопласта, будет остановлено.

Врезультате начавшийся процесс спорообразования превратится в обычный процесс вегетативного деления клеток.

Вконце этой стадии сближающиеся участки мембраны сливаются и меньший из протопластов (проспора) покрывается второй оболочкой, синтезируемой мембраной материнской клетки (рис. 35).

При этом спорогенная зона изолируется от остальной части ЦП. Таким образом внутри клетки возникает новая клетка-проспора, окруженная, в отличие от материнской, двумя трехслойными мембранами — внутренней и внешней. У од-

них видов проспора остается у полюса клетки, у других видов занимает центральное положение. С этого момента начинается необратимая фаза споруляции.

3.Образование кортекса — оболочки между внутренней и внешней мембранами проспоры, состоящей из особых молекул пептидогликана (рис. 36). Кортекс играет защитную роль: он предохраняет сердцевину спор от литических ферментов.

4.Стадия созревания. С внешней стороны наружной мембраны споры образуется внешняя плотная споровая оболочка, в состав которой входят белки, липиды и кальциевая соль дипиколиновой кислоты.

Снаружи у многих видов анаэробов спора покрывается еще одной дополнительной полипептидной оболочкой — экзоспориумом (рис. 37).

Он имеет вид многослойного чехла, в котором расположена спора. Возникает экзоспориум на ранней стадии формирования споры в виде небольшого пузырька на внешней мембране проспоры, затем пузырек разрастается и охватыва-

54

ет спору со всех сторон. После механического удаления экзоспориума процесс прорастания спор не нарушается.

5. Отмирание вегетативной части клетки. На завершающей стадии спорообразования происходит резкое возрастание активности литических ферментов, полностью разрушающих материнскую вегетативную клетку (рис. 38).

Спора выходит в окружающую среду, где может сохраняться потенциально жизнеспособной тысячи лет (стадия покоя).

Генетический контроль спорообразования. Синтез новых белковых ве-

ществ, споровых оболочек, кортекса и экзоспориума осуществляется при активном контроле генома материнской клетки. Роль материнской клетки сводится к тому, чтобы отделить от себя дочернюю клетку, оказавшуюся внутри ее ЦП. Но т. к. удалить проспору за пределы клеточных границ через ЦПМ и КС невозможно, то материнская клетка изолирует дочернюю от себя, окружая проспору мощными слоями белковой оболочки и переводя ее в анабиотическое состояние. Но это не спасает материнскую клетку от гибели. Хотя она продолжает еще длительное время активно функционировать, даже иногда способна образовать еще одну спору, но все же она не в состоянии вернуться к вегетативному развитию.

Прорастание споры. При попадании в благоприятные условия спора начинает прорастать в вегетативную клетку. Прорастание длится 4–5 ч, т. е. в 5 раз быстрее, чем спорообразование. Обычно не все споры, вносимые в благоприятную среду, прорастают сразу. Некоторые споры остаются непроросшими в течение различного времени, не теряя своей жизнеспособности.

Способ и время прорастания молодых спор являются постоянными и могут служить видовыми признаками. Если перенести только сформировавшиеся споры в благоприятную питательную среду, их прорастание начинается не сразу, а через 2–3 ч. Старые споры прорастают более длительно.

Стадии прорастания споры:

1.Набухание, связанное с увеличением в споре количества воды.

2.Дерепрессия генома и активация ферментов, участвующих в энерге-

тическом и пластическом метаболизме. На начальной стадии прорастания спор происходит выделение в среду экссудата прорастания. Половину его сухой массы составляет дипиколинат кальция, остальная часть экссудата прорастания представлена свободными аминокислотами, высокомолекулярными и низкомолекулярными белковыми веществами.

Активация ферментов происходит при обработке спор незначительными количествами некоторых веществ (L-аланина, пуриновых нуклеозидов, глюкозы, аденозина), кипячением или пастеризацией, умеренным воздействием ультразвука. Под действием активаторов дипиколиновая кислота, связывающая фер-

55

менты, подвергается деполимеризации и неактивная ферментная система превращается в активную.

Напротив, наличие в среде некоторых веществ (мышьяковистых соединений, углекислого натрия, высоких концентраций ряда аминокислот — глицина, метионина, цистеина, валина, D-аланина) угнетает процесс прорастания спор. Механизм угнетающего действия ряда факторов на прорастание спор окончательно неясен.

3. Разрушение плотных оболочек споры под влиянием давления, вызван-

ного ростом. Через образовавшееся отверстие в оболочке споры молодая клетка (проросток, ростовая трубка) выходит в среду и начинает расти (рис. 39). При этом из одной споры образуется одна вегетативная клетка, которая начинает делится (рис. 40).

Выросты на спорах. Особенностью спорообразования у анаэробов является формирование на спорах выростов разнообразной формы в области контактирующих мембран материнской клетки и проспоры. Каждому виду анаэробных бактерий свойствен свой тип строения выростов, этот признак наследственно закреплен и очень устойчив. Выросты состоят в основном из белка, в веществе выростов также обнаружены полисахариды и липиды.

Предположения о функции выростов на спорах:

–ответственны за контакт клеток в системе спорангий — спора;

–подают споре при благоприятных условиях «команду» на прорастание;

–играют важную роль в созревании спор, участвуют в формировании споровых покровов и кортекса;

–являются результатом нарушений в нормальном обмене веществ.

Колпачки на спорах. На спорах анаэробов образуются колпачки ячеистого строения. Ячейки — мешочки, заполненные газообразным веществом. Функция колпачков — увеличение подвижности и плавучести спор в водной среде, что способствует их распространению в природе. Подобно понтонам ячеистые колпачки не позволяют спорам тонуть. Споры с колпачками не удается осадить даже при центрифугировании.

Функции эндоспор:

1.Способность бактерий образовывать споры позволяет сохранить наследственную информацию при попадании вегетативной клетки в неблагоприятные условия внешней среды и способствует сохранению вида. Споры могут оставаться жизнеспособными в течение десятков, сотен и даже тысяч лет. Жизнеспособные споры были выделены из египетских мумий, трупов мамонтов.

2.Длительное существование спор бактерий в покоящемся состоянии в окружающей среде имеет существенное эпидемиологическое значение. Попадание спор патогенных бактерий в глубокие колотые и резаные раны, в которых

56

создается анаэробиоз, может привести к возникновению анаэробной раневой инфекции (столбняка или газовой гангрены).

3. Способность бактерий образовывать споры, различающиеся по форме, размерам и локализации в клетке, является таксономическим видовым призна-

ком, который используется для идентификации.

Форма спор может быть овальной, шаровидной, яйцевидной, цилиндрической.

Размер спор у бацилл приблизительно равен диаметру клетки, поэтому последняя не меняет формы. У клостридий размер спор превышает диаметр клетки, поэтому она расширяется в середине и принимает форму веретена.

Расположение спор в клетке может быть центральное (у сибиреязвенной бациллы), терминальное (у клостридий столбняка), субтерминальное (у клостридий ботулизма и газовой гангрены).

Выявление эндоспор:

1.При обычных способах окраски споры не прокрашиваются и имеют вид неокрашенных пустот внутри окрасившихся вегетативных клеток, т. к. плотная оболочка спор непроницаема для воды. Споры видны благодаря своему высокому показателю преломления — такому же, как у обезвоженного белка. Это указывает на содержание в спорах бактерий большого количества богатого белком материала, сконцентрированного в малом объеме. Спора содержит почти все сухое вещество материнской клетки, но занимает в 10 раз меньший объем.

2.Специальные методы окраски используют в сомнительных случаях. При этом используют протравы, которые разрыхляют оболочку споры и облегчают проникновение красителя. Окрасившиеся споры кислотоустойчивы в отличие от вегетативного тела микробной клетки, обесцвечивающегося под действием кислоты.

Окраска по Ожешко:

– на высушенный нефиксированный мазок (толстый, на краю стекла) наносят несколько капель 0,5%-ной HCl и подогревают 1–2 мин до закипания, остатки кислоты сливают;

– остывший препарат промывают водой, подсушивают, фиксируют на пламени горелки;

– далее красят как по Цилю–Нильсену, для до-

ные) обладают кислотоустойчивостью в отличие от вегетативных тел микробных клеток (синих или зеленых) (рис. 41).

4.ФКМ.

5.Электронная микроскопия.

Экзоспоры, в отличие от эндоспор, образуются вне бактериальной клетки и являются способом размножения у актиномицетов. На одну бактериальную клетку приходится не одна, а много спор. Экзоспоры менее устойчивы во внешней среде.

57

Рис. 42. Строение клетки спирохеты:

а — в продольном разрезе; б — в поперечном разрезе: 1 — протоплазматический цилиндр, 2 — наружная мембрана КС, 3 — осевые фибриллы (аксистиль), 4 — блефаропласт (место прикрепления осевых фибрилл), 5 — пептидогликановый слой КС, 6 — ЦПМ

Клетка спирохет содержит два набора осевых фибрилл, прикрепленных субполярно у каждого клеточного конца. Каждая осевая фибрилла тянется вдоль всей клетки спирохеты. Пучки фибрилл, прикрепленных у разных полюсов, в центральной части перекрываются.

На обоих концах протоплазматического цилиндра расположены субтерминальные прикрепительные диски — блефаропласты. Каждая из осевых фибрилл прикрепляется на одном конце протоплазматического цилиндра к блефаро-

б

пласту и тянется к противоположному концу цилиндра, обвивая его. Другой неприкрепленный конец осевой фибриллы свободен и выходит за конец протоплазматического цилиндра, создавая впечатление истинного наружного полярного жгутика. Однако истинные жгутики крепятся в ЦПМ и отходят от нее радиально, в то время как осевые фибриллы располагаются вдоль протоплазматического цилиндра и заключены во внешнюю оболочку (наружную мембрану), поэтому иногда именуются периплазматическими жгутиками, или эндожгутиками.

Протоплазматический цилиндр в 2 раза длиннее осевых фибрилл. Различают первичные завитки, когда протоплазматический цилиндр накручивается на осевые фибриллы, и вторичные завитки — изгибы всего тела спирохеты.

Спирохеты в жидких средах совершают движения трех типов: быстрое вращательное вокруг длинной продольной оси, сгибательное и поступательное (штопорообразное, винтообразное). Они также способны скользить по твердому субстрату.

Морфологические различия патогенных спирохет приведены в табл. 8.

59