2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Общая медицинская микробиология

няются среди различных видов бактерий, встраиваясь и перемещаясь среди хромосом, плазмид, умеренных фагов.

Транспозоны имеют особые концевые структуры нескольких типов, позволяющие отличать их от других фрагментов ДНК. Это позволило обнаружить

169

транспозоны не только у бактерий и дрожжей, но и в клетках растений, насекомых, позвоночных животных и человека. При интеграции транспозонов в хромосому клеток животных или человека они приобретают сходство с провирусами.

Состояние транспозонов в бактериальной клетке:

–интегрированное в репликон (реплицируется вместе с ним). При включении в бактериальную ДНК транспозоны вызывают в ней дупликации, а при перемещении — делеции и инверсии;

–свободное автономное (замыкается в кольцо и не реплицируется).

Таким образом, транспозоны, как и IS-последовательности, не способны к

самостоятельной репликации и размножаются только в составе бактериальной хромосомы.

Отличие транспозонов от IS-последовательностей: содержат в своем со-

ставе не только гены транспозиции, но и структурные гены.

Состав транспозонов:

–один или несколько специфических структурных генов, детерминирующих синтез молекул со специфическими биологическими свойствами: токсинообразование, синтез ферментов (например, гемолизинов, лактазы), резистентность к антибиотикам, устойчивость к солям тяжелых металлов;

–гены транспозиции: два IS-элемента — концевые структуры, отличающие транспозон от других фрагментов ДНК.

По особенностям строения различают (рис. 73):

1. Составные транспозоны — в их состав входят два полных IS-элемента, фланкирующих центральную часть, которая содержит гены резистентности к антибиотикам или гены термолабильного токсина. IS-элементы содержат информацию о способности к транспозиции. У некоторых транспозонов этого типа такая информация сохраняется только в одном из IS-элементов, а во втором гены, кодирующие эту информацию, инактивированы мутациями. На концах IS-эле- ментов имеются короткие инвертированные повторяющиеся последовательности, имеющие важное значение для транспозиции, т. к. именно они узнаются ферментом транспозазой, осуществляющим транспозицию.

2. Транспозоны ТnЗ-семейства — не содержат в своем составе IS-элементы,

аограничены высокогомологичными инвертированными концевыми повторами, состоящими из 35–48 пар нуклеотидов; центральные области этих транспозонов содержат информацию об их транспозиции, а также гены, не связанные с транспозицией (например, кодирующие резистентность к антибиотикам или к ртути).

Пути перемещения транспозонов:

–консервативный — транспозон вырезается из одного участка и перемещается в другой без увеличения количества копий, при этом участок ДНК, откуда вырезается транспозон, утрачивает свою функцию;

–репликативный — синтезированная копия транспозона перемещается в новое место, при этом увеличивается количество копий. Новые копии транспозонов могут мигрировать в плазмиды и ДНК фагов, которые в свою очередь, проникая в бактериальные клетки, способствуют их распространению в популяции.

169

а

б

Рис. 73. Классы бактериальных транспозонов:

а — инсерционный элемент (IS) (i); составной транспозон (ii) — (Tn10); б — Tn3 и Tn501 — транспозоны семейства Tn3 (стрелки на концах транспозонов — короткие инвертированные последовательности, узнаваемые ферментом траспозазой (ген tpn); tet, amp и mer — гены в составе транспозонов, кодирующие резистентность к тетрациклину, ампициллину и солям ртути соответственно)

Биологическая роль транспозонов:

1.Регуляторная — участвуют в регуляции активности (инактивации или активации) генов. Обеспечивая перенос генов внутри клетки, способствуют их интеграции в плазмиды и бактериофаги и распространению в популяциях бактерий разных видов, придавая им новые свойства, часто связанные со способностью выживать в неблагоприятных условиях. Интеграция транспозонов может привести к экспрессии соседнего «молчащего» гена.

2.Кодирующая — осуществляют горизонтальный перенос генов, несущих информацию о синтезе токсинов, ферментов. Некоторые транспозоны приобретают новые гены резистентности к антибиотикам, существующие в виде генных циркулярно-замкнутых кассет. Это происходит, когда в составе транспозона содержатся дополнительные генетические структуры — интегроны, отвечающие за сайт-специфическую рекомбинацию. Интегроны содержат ген интегразы, промотор и сайт интеграции. С помощью фермента интегразы захватывают генные кассеты, внедряют их в специфический сайт интегрона и экспрессируют их со своего промотора.

3.Индукция геномных мутаций разного типа.

4.Являются генетическими маркерами вида (рода) бактерий. Сравнительная характеристика внехромосомных факторов наследственно-

сти приведена в табл. 36.

Все внехромосомные факторы наследственности не являются жизненно необходимыми генетическими элементами для бактериальных клеток, т. к. не несут информации о синтезе ферментов, участвующих в пластическом или энер-

170

гетическом метаболизме. Закодированная в них генетическая информация важна для клеток популяции только в данных конкретных условиях ее существования и может давать бактериям селективные преимущества. Изменение условий существования (попадание бактерий во внешнюю среду или невосприимчивый организм) лишает их этих преимуществ.

Таблица 36

Сравнительная характеристика внехромосомных факторов наследственности

Геном (генотип) бактерий (от греч. genos — рождение и typos — отпечаток, образ) — совокупность всех генов бактерий.

До 1956 г. все бактериальные хромосомы считались линейными. В 1956 г. Жакоб и Вольман предложили кольцевую модель бактериальной хромосомы, которая была общепринятой до появления новых методов исследования ДНК. Затем с помощью электрофореза в пульсирующем поле (метод прямого анализа физической структуры хромосом) было показано, что у некоторых бактерий хромосомы являются линейными. В середине 90-х гг., когда были начаты расшифровки полных нуклеотидных последовательностей геномов методом секвенирования, было выявлено, что ряд бактерий имеют сложные геномы, состоящие из двух или нескольких репликонов. Например, геномы V. cholerae и B. melitensis представлены 2 кольцевыми хромосомами, а геномы L. interrogans и B. cereus — 1 кольцевой хромосомой и 1 мегаплазмидой.

171

Анализ полных нуклеотидных последовательностей геномов бактерий позволил получить информацию об организации геномов бактерий — их размерах, линейности или циркулярности, ГЦ-составе, количестве открытых рамок считывания (ORF), наличии дупликаций и амплификации некоторых из них, выявить родственные и уникальные гены у различных бактерий (табл. 37).

Оказалось, что многие бактерии, относящиеся к различным таксономическим группам, обладают генами, имеющими общее происхождение. Их распространение осуществлялось путем горизонтального переноса генов — механизма, признанного сейчас одним из основных «двигателей» в эволюции бактерий.

В составе геномов бактерий были обнаружены гены эукариот, а в геноме человека и других эукариот — гены бактерий. Это подтвердило сложившееся после открытия мобильных генетических элементов представление о существовании общего генофонда всего живого мира, обмена генами не только между разными видами и родами бактерий, но и между совершенно неродственными организмами — бактериями и высшими животными и растениями.

ИЗМЕНЧИВОСТЬ БАКТЕРИЙ

Изменчивость бактерий — способность приобретать новые признаки, закреплять их в потомстве и сохранять. Изменчивость — один из главных факторов эволюции. Она служит источником для отбора форм, наиболее приспособленных к условиям существования. Изменчивость может быть генотипической и фенотипической (табл. 38).

Таблица 38

Сравнительная характеристика изменчивости

172

Изменчивость бактерий имеет большое прикладное значение в диагностике, лечении и профилактике инфекционных заболеваний. Так, образование L-форм бактерий приводит к ложноотрицательным результатам культурального метода исследования. Возникновение антибиотикорезистентности является чрезвычайно актуальной проблемой в лечении инфекционных заболеваний. Наконец, формирование типоспецифического иммунитета делает возможным повторные случаи инфекционных заболеваний.

ГЕНОТИПИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ

Генотипическая (наследственная) изменчивость — наследуемые изменения генетического аппарата бактерий, возникающие в результате мутаций или генетических рекомбинаций.

Мутации (лат. mutatio — изменение) — скачкообразные стойкие изменения наследственного признака (признаков), возникающие в результате изменения первичной структуры ДНК (последовательности одной или нескольких пар нуклеотидов). Мутации у бактерий носят ненаправленный характер, в их основе лежат ошибки копирования наследственной информации, возникающие при репликации.

Мутации проявляются в фенотипе в виде утраты или изменения признаков: морфологических (жгутиков, пилей, капсулы, КС), биохимических (способности ферментировать углеводы, синтезировать аминокислоты, витамины), возникновения резистентности к лекарственным или дезинфицирующим веществам, изменения чувствительности к температуре, снижения вирулентности (аттенуации). Мутанты, нуждающиеся в определенных аминокислотах, азотистых основаниях, ростовых факторах, называются ауксотрофными. Они могут сохранять способность к росту лишь в том случае, если утрата фермента компенсируется наличием

всреде готового продукта, образуемого при его непосредственном участии.

Классификации мутаций:

А. По происхождению:

I. Спонтанные — возникающие самопроизвольно, без преднамеренного экспериментального воздействия, под влиянием природных факторов или в результате физиологических изменений в клетке.

Спонтанные мутации составляют естественный (спонтанный) фон, величи-

на которого колеблется в зависимости от типа мутации и вида микробной популяции в пределах 10–7–10–10. При высоких скоростях роста частота мутирования постоянна, и ее обычно определяют для клеток в экспоненциальной фазе роста при оптимальных условиях среды. Спонтанные мутации могут обусловливать благоприятные и неблагоприятные генетические изменения.

Причины спонтанных мутаций:

1. Ошибки в работе ДНК-полимеразы во время репликации ДНК и неправильного формирования комплементарных пар оснований. Мутации происходят

врезультате ошибочного включения в синтезируемую дочернюю цепь вместо одного азотистого основания другого, некомплементарного, имеющегося в родительской цепи, например, вместо аденина, комплементарного тимину, гуанина или цитозина.

173

2.Инсертационные мутации, возникающие при встраивании в нуклеоид внехромосомных факторов наследственности (IS-последовательностей, транспозонов, плазмид). Фенотип мутации зависит от места их интеграции: если она происходит вблизи промотора, то нарушается функция регуляторного гена, если вблизи структурного гена — синтез закодированного в нем продукта. При наличии у бактерий генов-мутаторов частота мутаций увеличивается в 100 и более раз.

3.Ошибки в работе репарирующих ферментов.

II. Индуцированные — возникают под влиянием мутагенов — внешних факторов физической, химической или биологической природы, повреждающих ДНК. Общее число мутагенов в настоящее время измеряется несколькими сотнями.

Мутагены (мутагенные факторы) — (лат. mutatio — изменение и греч. genesis — развитие) — химические вещества или физические факторы, вызывающие предмутационные изменения в ДНК или РНК (в случае РНК-вирусов), которые в результате ошибок в работе репарирующих ферментов или в процессе репарации переходят в мутацию.

Классификация мутагенов по природе:

1.Физические (УФ-излучение, -излучение, температура) — оказывают прямое и опосредованное (окислительные и деструктивные процессы под действием свободных радикалов) повреждающее действие на основания ДНК.

2.Химические:

а) ингибиторы предшественников нуклеиновых кислот; б) аналоги азотистых оснований (5-бромурацил, 2-аминопурин);

в) алкилирующие соединения (гидроксиламин, азотистая кислота); г) окислители; д) восстановители;

е) свободные радикалы; ж) акридиновые красители;

з) производные нитрофуранового ряда.

Часть химических мутагенов действует лишь при синтезе ДНК, другие способны вызывать мутации, действуя на покоящуюся ДНК.

3. Биологические (вирусы, транспозоны).

Классификация мутагенов по механизму действия:

1. Аналоги азотистых оснований замена пар оснований.

Азотистая кислота дезаминирует азотистые основания, в результате чего после нескольких актов редупликации ДНК в ней происходит замена пар оснований гуанин–цитозин (ГЦ) на аденин–тимин (AT). Гидроксиламин во внеклеточных вирусах действует только на цитозин, что приводит к замене ГЦ на AT.

Аналог тимина, 5-бромурацил, замещает тимин у фагов и бактерий в процессе редупликации их ДНК, что может привести к замене пары AT на ГЦ.

2. Акридиновые красители выпадения или вставки оснований.

Этилэтансульфонат и этилметансульфонат вызывают алкилирование гуа-

нина и его отщепление от рибозофосфатного скелета и другие повреждения в ДНК.

174

3. УФ-излучение, некоторые продукты микробного метаболизма (формальдегид) нарушение работы ДНК-полимеразы образование тиминовых димеров — «сшивок» между соседними молекулами тимина.

4. Нитрозосоединения множественный эффект («супермутагены»). Нит-

розонитрометилгуанидин и нитрозопроизводные мочевины алкилируют цито-

зин, вызывая его замену тимином. Они характеризуются чрезвычайно высокой эффективностью при незначительном летальном действии, извращают синтез предшественников ДНК, дезаминируют некоторые основания.

Б. По проявлению мутации в фенотипе:

I. Проявленные (доминантные).

II. Непроявленные (молчащие, рецессивные). Первичный эффект мутагенно-

го фактора не обязательно ведет к истинной мутации. Новый фенотип проявляется только тогда, когда измененный ген начнет функционировать.

В. По направленности действия:

I. Прямые — первичные мутации от дикого типа к мутантному фенотипу (потеря или изменение признака).

II. Обратные (реверсии) — мутации, обусловившие возврат к дикому фенотипу (восстановление признака):

1.Истинные реверсии — вторичная мутация в этом же гене точно восстанавливает исходный генотип, как следствие — восстанавливается и фенотип. Это может произойти, если прямое мутационное изменение состоит в простой замене пары оснований в первично мутировавшем гене. Так, если прямая мутация — результат замены пары AT на ГЦ, то обратная мутация — результат замены пары ГЦ на AT.

2.Супрессорные вторичные реверсии — подавление мутантного фенотипа, которое выражается в исправлении мутационного изменения, т. е. восстанавливается только фенотип, но не генотип. Различают супрессорные мутации:

а) внутригенные — в исходном гене: если при первой мутации произошла вставка или выпадение пары нуклеотидов в одном из участков ДНК одного и того же гена, а в другом — мутация противоположного рода (выпадение или вставка), то правильность считывания информации восстанавливается.

б) внегенные — в других участках хромосомы в генах-супрессорах, кодирующих синтез транспортных РНК, в результате чего в синтезируемый полипептид доставляется нужная аминокислота.

Для точечных мутаций частота реверсий довольно высока, в то время как для аберраций реверсии не характерны.

Г. По фенотипическим последствиям для мутировавшей клетки:

I. Нейтральные — безразличны для популяции, фенотипически не проявляются изменениями признаков, т. к. заметно не отражаются на функциональной активности синтезируемого фермента.

II. Условно-летальные (полулетальные) — приводят к изменению, но не к утрате функциональной активности фермента. В зависимости от условий окружающей среды микроорганизмы могут сохранять или утрачивать свою жизнеспособность. Так, например, ts-мутанты (температурочувствительные) бактерий сохраняют способность к синтезу ферментов, функционирующих при 37 ºС, но

175

утрачивают этот признак при 42 ºС. В то же время у бактерий дикого типа соответствующие ферменты активны при обеих температурах.

III. Летальные — характеризуются полной утратой способности синтезировать жизненно важный для бактериальной клетки фермент. Чаще всего это хромосомные (делеции) или генные мутации (в генах, несущих информацию о синтезе ДНК-полимераз).

IV. Полезные — в любой микробной популяции в каждый момент времени существует множество особей с изменениями молекулярной конституции, обеспечивающих резистентность к неблагоприятным воздействиям (например, к антибиотикам).

Д. По характеру изменений в первичной структуре ДНК:

I. Точечные — замена или вставка пары азотистых оснований в ДНК, которая приводит к изменению одного кодона, когда повреждения ограничиваются одной парой нуклеотидов:

1.Вставки или выпадения одной пары нуклеотидов (мутации со сдвигом считывания).

2.Транзиции — замены одного пуринового основания на другое или одного из пиримидиновых оснований на другое.

3.Трансверсии — одно из пиримидиновых оснований заменяется пуриновым или наоборот.

Виды точковых мутаций по индуцируемым последствиям:

– миссенс-мутации — происходит изменение всех последующих кодонов,

врезультате вместо одной аминокислоты кодируется другая;

– нонсенс-мутации — образуется бессмысленный кодон, не кодирующий ни одну из аминокислот.

II. Генные — изменения одного гена.

III. Хромосомные (геномные аберрации) — изменения нескольких генов:

1. Нехватки — выпадение части хромосомы:

а) делеции — утрата нескольких пар нуклеотидов в середине хромосомы; б) дефишенсии — потеря концевого участка хромосомы.

2.Дупликации (повторения) — удвоение участка хромосомы.

3.Инверсии (перевороты) — отрыв участка хромосомы, поворот его на 180º и прикрепление к месту отрыва.

4.Инсерции (вставки) — вставки коротких или протяженных последовательностей посторонней ДНК.

5.Транспозиции (перемещения, горизонтальный перенос генов) — перемещение группы нуклеотидов (IS-последовательностей или транспозонов) в пределах хромосомы из одного участка ДНК в другой или из репликона в репликон (из хромосомы в плазмиду и наоборот). Транспозиции могут вызывать делеции или инверсии генетического материала, а при включении в новый участок ДНК — дупликации в 6–9 пар нуклеотидов.

Теоретически мутации могли бы привести к вымиранию бактериальной популяции, однако в любой живой клетке существуют биохимические механизмы, способные полностью или частично восстанавливать исходную структуру ДНК.

176

Механизмы восстановления повреждений ДНК:

А. Репарации.

I. Световая репарация (фотореактивация) — репарационная система,

осуществляющая реверсию поврежденной УФ-излучением ДНК к исходной структуре под действием дополнительного УФО.

При УФО фагов, бактерий и простейших наблюдается резкое снижение их жизнедеятельности. Однако их выживаемость резко повышается при дополнительном воздействии видимым светом. Оказалось, что под действием УФ-излу- чения в молекуле ДНК образуются димеры (химические связи между двумя пиримидиновыми основаниями одной цепочки), что препятствует считыванию информации. Видимый свет активирует ферменты, разрушающие димеры.

Световая репарация осуществляется несколькими ферментами:

–фотолиазой — расщепляет тиминовый димер и восстанавливает целостность соседних тиминовых оснований;

–О6-метилтрансферазой — удаляет О6-метильную группу из остатков гуанина после действия метилирующих агентов;

–ДНК-пурин инсертазой — осуществляет встраивание утерянного при мутации основания в апуриновый сайт;

–ДНК-гликозилазой — удаляет дефектные основания.

Все эти процессы происходят в один этап под действием конкретного фермента и безошибочно восстанавливают исходную структуру ДНК.

II. Темновая репарация — эксцизия (удаление) неправильно спаренных или поврежденных оснований из ДНК с последующим восстановлением исходной структуры. Темновая репарация осуществляется несколькими ферментами в две фазы:

1. Дорепликативная (до удвоения молекулы ДНК):

–эндонуклеаза распознает место повреждения, расщепляет цепь ДНК вблизи дефекта;

–экзонуклеаза удаляет поврежденный фрагмент;

–ДНК-полимераза восполняет дефект, проникает в брешь и встраивает в нее отсутствующие нуклеотиды на матрице второй сохранившейся нити ДНК.

2. Пострепликативная (после удвоения молекулы ДНК): осуществляется путем рекомбинаций, при этом дефекты ДНК застраиваются фрагментами неповрежденных нуклеотидов. ДНК-лигаза сшивает вновь синтезированный участок

сосновной нитью ДНК.

Темновая репарация основана на ресинтезе нуклеотидной цепи на базе неповрежденной матрицы, поэтому она также является практически безошибочной.

Б. Активация механизмов, обеспечивающих резистентность к повре-

ждениям. Кроме механизмов исправления повреждений, клетки имеют возможность обойти вызванную повреждениями блокаду репликации ДНК, например, путем репарации в процессе рекомбинации.

В. Обратная мутация (истинная реверсия) — измененный при первой му-

тации генотип точно восстанавливается второй мутацией, в результате чего восстанавливается и фенотип (например, измененный при первой мутации триплет после второй мутации будет кодировать ту же аминокислоту, что и раньше).

177