2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Общая медицинская микробиология

жащих соединений с длиной цепи С2–С3. В обоих случаях используются реакции гликолиза, идущие в обратном направлении.

Биосинтез аминокислот. Большинство прокариот способны синтезировать все аминокислоты из пирувата, α-кетоглутарата и фумарата, образующихся в цикле трикарбоновых кислот. Источниками энергии являются АТФ. Азот вводится в молекулу предшественника на последних этапах биосинтеза реакциями аминирования и пераминирования.

Из пирувата в реакциях аминирования ионами NH4 образуется аланин, а затем в реакциях пераминирования синтезируются пролин и аргинин. Глютаминовая кислота образуется из -кетоглютарата путем аминирования.

Лизин, треонин и метионин синтезируются из аспартата, образованного из фумарата.

Ауксотрофные по некоторым аминокислотам прокариоты (микоплазмы, спирохеты) используют готовые аминокислоты из организма хозяина.

Биосинтез липидов. Липиды микроорганизмов представлены жирными кислотами, фосфолипидами, восками, терпенами и каратиноидами, состоящими из насыщенных и ненасыщенных жирных кислот.

Жирные кислоты синтезируются при участии ацетилпереносящих белков. Ненасыщенные кислоты с двойными связями формируются из насыщенных жирных кислот.

Ионный обмен. Для роста и размножения микроорганизмов необходимы разнообразные минеральные элементы и соединения — ионы NH4, K+, Mg2+. Ионы аммония необходимы для синтеза аминокислот, ионы калия — для связывания тРНК с рибосомами, ионы железа и магния являются костимуляторами ферментативных реакций.

Пути выхода синтезированных веществ из бактериальной клетки:

–фосфотрансферазная реакция происходит при фосфорилировании переносимой молекулы;

–контрансляционная секреция — в этом случае синтезируемые молекулы должны иметь особую лидирующую последовательность аминокислот, чтобы прикрепиться к мембране и сформировать канал, через который молекулы белка (например, токсины столбняка, дифтерии) смогут выйти в окружающую среду;

–почкование: молекулы, образующиеся в клетке, окружаются мембранным пузырьком, который отшнуровывается в окружающую среду.

ПУТИ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНЕРГИИ У ПРОКАРИОТ

Для синтеза структурных компонентов микробной клетки и поддержания процессов жизнедеятельности, наряду с питательными веществами, требуется достаточное количество энергии.

В зависимости от источника и механизма преобразования энергии в до-

ступную для клетки биохимическую форму (АТФ) микроорганизмы подразделяют на 2 группы (табл. 20):

1. Фототрофы (фотосинтезирующие) — получают энергию путем фото-

синтеза (солнечную энергию они превращают в химическую); имеют циклический транспорт электронов, в результате которого образуется АТФ.

99

К фототрофам относятся сапрофитные микроорганизмы, которые в зависимости от природы доноров электронов подразделяются на 2 группы:

–фотолитотрофы (фотоаутотрофы) — осуществляют кислородный фотосинтез, получают химическую энергию в хроматофорах с помощью хлорофилла (аэробные зеленые и пурпурные серобактерии, цианобактерии, водоросли

изеленые растения);

–фотоорганотрофы (фотогетеротрофы) — осуществляют бескисло-

родный фотосинтез (анаэробные несерные пурпурные бактерии).

2. Хемотрофы (хемосинтезирующие) — получают энергию за счет окис-

лительно-восстановительных реакций. В зависимости от природы доноров электронов хемотрофы подразделяются на 2 группы:

–хемолитотрофы (хемоаутотрофы) — донором электронов являются неорганические соединения (сера, сероводород, сернистая кислота, соли железа, метана, водорода). Например, железобактерии получают энергию при окислении железа; бактерии, метаболизирующие серу, обеспечивают себя энергией за счет окисления серосодержащих соединений. Некоторые хемолитотрофы способны к гетеротрофному метаболизму, если органические соединения доступны для питания (нитрифицирующие бактерии, переводящие аммоний в нитраты и принимающие участие в круговороте азота);

–хемоорганотрофы (хемогетеротрофы) — донором электронов являются органические соединения (табл. 21); к ним относятся животные и основная масса микроорганизмов, в т. ч. патогенные.

Сравнительная эффективность различных способов получения энергии у гетеротрофов

100

ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ МЕТАБОЛИЗМ

Процесс получения энергии у прокариот — дыхание (биологическое окисление), в результате которого синтезируются молекулы АТФ. У некоторых микроорганизмов аккумулятором энергии могут быть и другие фосфаты, иногда даже неорганические.

Дыхательный аппарат бактерий состоит из мезосом — инвагинаций ЦПМ, где локализованы ферменты-оксидоредуктазы, с помощью которых происходит биологическое окисление:

–пиридиновые дегидрогеназы (есть у всех микроорганизмов), отнимают от субстрата водород и таким образом происходит окисление. Облигатные анаэробы имеют только эти ферменты;

–флавиновые ферменты широко распространены и делятся на 2 группы: флавинодегидрогеназы (окисляют субстрат, отнимая у него водород) и ферменты переноса (только передают водород, забирая его у пиридиновых дегидрогеназ);

–железосодержащие ферменты (цитохромы) — цитохромоксидаза, пе-

роксидаза, каталаза — сами субстрат не дегидрогенируют, а выполняют роль переносчика водорода на кислород;

–медьсодержащие ферменты мало распространены (фенолоксидаза). Они сами дегидрогенируют субстрат и переносят водород на кислород.

Кроме ферментов, локализованых в мезосомах, у микроорганизмов есть

свободные переносчики водорода (убихиноны, аскорбиновая кислота). Они вступают в действие, когда мембрана растягивается и наблюдается разрыв между локализованными ферментами.

Типы биологического окисления. В зависимости от того, что является конечным акцептором электронов, выделяют три типа образования энергии у бактерий: аэробное дыхание, анаэробное дыхание и ферментацию (брожение)

(рис. 57, 58).

1. Аэробный (от греч. аer — воздух и bios — жизнь) тип — окислительное фосфорилирование — совокупность экзотермических процессов ферментативного распада органических веществ (реже — неорганических), происходящих с участием свободного кислорода.

Процесс дыхания у аэробов протекает по типу окислительной реакции путем отщепления от субстратов водорода (или электронов). Чаще наблюдается гликолиз — процесс ферментативного расщепления углеводов. Пировиноградная кислота, образовавшаяся в результате гликолиза, окисляется в цикле трикарбоновых кислот, который снабжает аэробов предшественниками для реакций биосинтеза.

Водородные атомы передаются вдоль цепи молекул-переносчиков, которые образуют цепь переноса электронов, или «дыхательную» цепь. Водород и электроны отщепляются от субстратов с помощью пиридиновых дегидрогеназ, связанных с мембранами. Далее поток электронов направляется от системы с более низким (более отрицательным) потенциалом к системе с более высоким (более положительным) потенциалом: флавопротеидные ферменты — цитохромные ферменты — цитохромоксидаза. На последней ступени этой реакции, катали-

101

зируемой цитохромоксидазой, ионы водорода связываются с молекулярным кислородом — конечным акцептором электронов. При этом образуется перекисный радикал — очень сильный окислитель. Фермент супероксиддисмутаза переводит перекисный радикал в перекись водорода, которая ферментами каталазой или пероксидазой преобразуется в безвредные продукты — воду и кислород. Таким образом, специфические ферменты защищают микробную клетку от токсических продуктов окисления.

Анаэробное дыхание

Дыхание

Рис. 58. Транспорт электронов при различных типах биологического окисления: ПН — пиридиннуклеотидные ферменты; ФП — флавопротеидные ферменты

102

Аэробное дыхание энергетически более эффективно. Перенос электронов вдоль дыхательной цепи сопряжен с образованием богатых энергией фосфатных связей в молекулах АТФ. Образуется также много промежуточных и конечных продуктов метаболизма, которые используются для синтеза белков, углеводов, витаминов. Филогенетически аэробное дыхание возникло позже.

Облигатным (строгим) аэробам для дыхания необходим молекулярный (атмосферный) кислород. Они не могут жить и размножаться в отсутствие молекулярного кислорода, используют только аэробный путь окисления (некоторые виды псевдомонад, холерный вибрион, туберкулезная палочка).

Для аэробов, растущих на агаре или в тонких слоях жидкости в присутствии воздуха, кислорода вполне достаточно. В жидких средах при большом объеме жидкости аэробные бактерии могут расти только на поверхности, т. к. в более глубоких слоях по мере удаления от поверхности условия приближаются к анаэробным. Для нормального роста аэробных микроорганизмов в глубоких слоях жидкой культуры требуется аэрация.

Микроаэрофилы (факультативные аэробы) нуждаются в уменьшенной концентрации (низком парциальном давлении) свободного кислорода (от 0,01 до 0,03 бар). При полном доступе кислорода (в воздухе парциальное давление О2 составляет 0,2 бар) рост микроорганизмов прекращается или резко замедляется. Микроаэрофилами является большинство аэробных бактерий.

Капнофилы нуждаются в наличии в среде двуокиси углерода (до 10 %), т. к. приспособлены к более высокому, чем в воздухе, содержанию СО2. Для этого к питательным средам добавляют бикарбонат натрия и инкубируют культуры в закрытых сосудах в атмосфере, содержащей СО3-2; можно также продувать обычный или обогащенный СО2 воздух. Капнофилами являются многие патогенные бактерии.

2. Анаэробный (от греч. an — отрицание, аer — воздух и жизнь) тип — совокупность экзотермических процессов ферментативного распада органических веществ, происходящих без участия кислорода. Анаэробы получают энергию в форме АТФ путем ускоренного, но не полного окисления (субстратного фосфорилирования) углеводов, белков, липидов.

Различия между облигатными аэробами и анаэробами касаются ферментативного обеспечения конечных этапов окисления. У анаэробов дегидрогеназы не связаны с мембранами и находятся в ЦП только в растворимой форме. Для переноса водорода анаэробы используют флавиновые ферменты, самоокисляющиеся кислородом воздуха. Реакция флавиновых ферментов с кислородом направлена на детоксикацию молекулярного кислорода. Поэтому содержание флавиновых дегидрогеназ в клетках анаэробов значительно выше, чем у аэробов.

Из-за отсутствия ряда ферментов цепи переноса электронов (цитохромов) транспорт электронов осуществляется просто и примитивно. Органические субстраты окисляются только за счет отщепления водорода. Освобождающийся водород либо присоединяется к продуктам распада того же самого органического вещества, либо выделяется в газообразном состоянии. Если у анаэробов в каче-

стве акцепторов водорода в окислительно-восстановительных реакциях выступают неорганические вещества, происходит «анаэробное дыхание». Ко-

103

нечным акцептором водорода у анаэробов является связанный кислород в виде нитратов («нитратное дыхание») или сульфатов («сульфатное дыхание»).

Анаэробный путь филогенетически более ранний, чем аэробный, но он экономически невыгоден, т. к. выделяется небольшое количество энергии и образуется мало метаболитов. Из-за того что энергии выделяется мало, микроорганизмам надо использовать большое количество субстратов (сахаров, аминокислот, пуринов и пиримидинов). Многие анаэробы являются строго протеолитическими организмами, неспособными сбраживать углеводы. Протеолитическая активность у некоторых анаэробов (C. histolyticum) настолько высока, что при инфекциях, вызванных этими микроорганизмами, наблюдается расплавление мышц. Другие анаэробы обладают слабовыраженной сахаролитической активностью.

3. Если и донорами, и акцепторами водорода выступают органические соединения, происходит брожение — процесс ферментативного расщепления органических соединений, преимущественно углеводов, с образованием спиртов (этилового, пропилового, глицерина) и органических кислот (молочной, муравьиной, уксусной, масляной). Типы брожения именуются по продуктам, которые образуются: молочнокислое, уксуснокислое, спиртовое, муравьинокислое, маслянокислое, ацетонобутиловое, пропионовокислое, сукцинатное, смешанное

(рис. 59).

Рис. 59. Различные продукты ферментации пирувата

Образующиеся в процессе брожения продукты и энергия расходуются микроорганизмами для различных биосинтетических целей. Многие виды брожения используются в пищевой и микробиологической промышленности для получения спиртов и органических кислот.

Анаэробы осуществляют обмен веществ и размножаются в условиях отсутствия кислорода в среде обитания. Различают облигатных, аэротолерантных и факультативных анаэробов.

Облигатные (строгие) анаэробы (палочка маслянокислого брожения, возбудители столбняка, ботулизма) используют только анаэробный путь биологического окисления и размножаются только в анаэробных условиях. Они лишены ферментов супероксиддисмутазы и каталазы, защищающих микробную клетку от токсических продуктов окисления. Поэтому вегетативные формы облигатных

104

анаэробов погибают от ядовитых концентраций перекиси водорода даже при кратковременном контакте с воздухом. Спорам облигатных анаэробов свойствен крайне выраженный анабиоз, поэтому они могут сохраняться в присутствии кислорода.

Аэротолерантные микроорганизмы (молочнокислые бактерии, C. histolyticum) обладают супероксиддисмутазной активностью, но лишены каталазы и пероксидазы; они могут расти в присутствии атмосферного кислорода, но не способны его использовать; энергию получают исключительно с помощью бро-

жения.

Факультативные анаэробы (большинство патогенных бактерий, например, Enterobacteriaceae (кишечная палочка, сальмонеллы), многие дрожжи) об-

ладают супероксиддисмутазной и каталазной активностью. Факультативные анаэробы образуют АТФ при окислительном и субстратном фосфорилирова-

нии. Они могут изменять свой путь биологического окисления в зависимости от наличия или отсутствия кислорода. В кислородных условиях в качестве конечного акцептора водорода они используют атмосферный кислород. В бескислородных условиях в качестве конечного акцептора водорода они используют нитраты или сульфаты.

Классификация бактерий по отношению к кислороду воздуха представлена в табл. 22 и на рис. 60.

Рис. 60. Выявление типа дыхания микроорганизмов при культивировании в высоком столбике агара

105

Анаэробы очень широко распространены. Они являются возбудителями ряда опасных инфекционных заболеваний человека, используются в промышленности как продуценты ценных для народного хозяйства соединений.

МЕТАБОЛИЧЕСКОЕ НАПРАВЛЕНИЕ ЭВОЛЮЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

Пробионты, появившиеся 3,6 млрд лет назад, были первичными гетеротрофами и получали энергию при расщеплении органических веществ абиогенного происхождения, в изобилии имевшихся в окружающей среде. Примером древнего способа обмена веществ, дошедшего до наших дней, является гликолиз — ферментативное бескислородное расщепление глюкозы. По мере истощения запаса органического материала возникала жесткая конкурентная борьба за него, что ускорило процесс эволюции первичных гетеротрофов. Таким образом, первичными организмами нашей планеты были анаэробы (2,5–3 млрд лет назад).

Исключительным событием стало возникновение фотосинтеза у анаэробных бактерий. Фотосинтез освободил клетки от зависимости доступности органики абиогенного происхождения. Побочным продуктом фотосинтеза являлся кислород, накопление которого в атмосфере привело к коренному изменению хода эволюции. Появление озонового экрана защитило первичные организмы от смертельного УФО и положило конец абиогенному синтезу органики.

Первые аэробные бактерии появились 2,4–2,8 млрд лет назад благодаря приобретению аппарата окислительного фосфорилирования. Продукты брожения подвергались дальнейшему окислению до СО2 и Н2О. Аэробные (вторичные) гетеротрофы могли более эффективно, чем анаэробные (первичные) гетеротрофы, расщеплять органические вещества, образующиеся в результате фотосинтеза (рис. 61).

Я

Я

Рис. 61. Эволюция пробионтов

106

С ростом концентрации кислорода в атмосфере усложнялась жизнь первичных анаэробных гетеротрофов. Некоторые из них вымерли, другие нашли бескислородную среду (метанобразующие бактерии или серные бактерии, живущие в горячих подземных источниках).

Некоторые первичные гетеротрофы пошли по пути, приведшему к образованию эукариотических клеток. Часть из них вступила в симбиоз с аэробными бактериями, способными к окислительному фосфорилированию. Поглотив вторичных гетеротрофов, первичные не расщепили их на молекулы, а сохранили в качестве энергетических станций, называемых сегодня митохондриями. Такие симбионты дали начало царствам животных и грибов.

Другая часть первичных гетеротрофов «заключила союз» не только с аэробными гетеротрофами, но и с первичными фотосинтетиками, сохранив последних в качестве хлоропластов. Такие симбионты дали начало царству растений.

В пользу симбиотической теории образования эукариот говорят наличие двух мембран у митохондрий и хлоропластов (внутренняя — своя, наружная — образована клеткой-захватчиком) и идеальный генетический код, позволивший эукариотам отстранится от чужой генетической информации. Митохондрии и хлоропласты имеют кольцевую ДНК и бактериальные рибосомы потому, что их предки были бактериями.

Сравнительный биохимический анализ показывает, что в основе энергетического обмена всех без исключения организмов лежат одни и те же поразительно сходные между собой цепи реакций, не связанных с потреблением свободного кислорода, — реакции, которые происходят в клетках современных анаэробов.

РОСТ И РАЗМНОЖЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ

РОСТ

Рост микроорганизмов — генетически контролируемое увеличение объема и массы микробной клетки, связанное с синтезом новых веществ. Рост в применении к популяции — увеличение биомассы популяции.

Стадии (фазы) роста бактериальной культуры на питательной среде

(рис. 62). Каждая фаза роста культуры в питательной среде характеризуется определенным размером клеток, скоростью размножения и потребления субстрата, синтезом метаболитов.

A — фаза задержки роста (начальная стационарная), или лаг-фаза (от англ. lag — отставание), в среднем длится 1–2 ч. Начало лаг-фазы связано с адаптацией клеток к среде обитания. Важную роль играет «предыстория» выращивания посевной культуры. Если использован инокулят из культуры с резко отличающимися условиями выращивания, то клеткам требуется время на синтез новых рибосом, РНК и адаптивных ферментов. В этом периоде увеличивается размер клеток, в 8–12 раз повышается содержание РНК. Деления клеток при этом почти не происходит. Полноценная среда, физиологически активная посевная культура, которая подготовлена к синхронному делению, способствуют короткой лаг-фазе (или ее отсутствию) и переходу ко II фазе. Синхронизации можно до-

107

стичь с помощью пониженной температуры, ограничения питательных веществ, фильтрации, обеспечивающей пропускание клеток определенного размера.

Синхронизация длится 2–4 генерации, а далее наступает асинхронный рост.

Логарифм количества жизнеспособных клеток

Время

Рис. 62. Фазы роста бактериальной культуры в питательной среде:

A — лаг-фаза; B — период положительного ускорения; C — лог-фаза; D — фаза отрицательно-

го ускорения; E — стационарная фаза; F — фаза отмирания

B — короткий период положительного ускорения между фазами A и B,

когда начинается деление бактерии.

C — фаза логарифмического (экспоненциального) роста начинается, когда скорость роста клеток всей популяции достигает постоянной величины, средняя продолжительность ее 5–6 ч. Скорость деления клеток максимальная, но клетки имеют наименьший размер. Популяция бактериальной культуры состоит из делящихся клеток и достаточно стандартна по своим свойствам (содержание белка, нуклеиновых кислот, наиболее выраженные видовые признаки), поэтому эта фаза удобна для определения многих параметров популяции (плотность бактерий, скорости роста и потребления субстрата, содержание биополимеров клетки). В этот период отмечено снижение резистентности к агрессивным веществам.

Несмотря на постоянную скорость роста популяции бактерий в логарифмической фазе, отдельные клетки все же находятся в разных стадиях деления. Иногда важно синхронизировать рост всех клеток популяции, то есть получить синхронную культуру. Простыми методами синхронизации являются изменение температурных условий или культивирование в условиях недостатка питательных веществ. Вначале культуру помещают в неоптимальные условия, затем сменяют их оптимальными. При этом у всех клеток популяции синхронизируется цикл деления, но синхронное деление клеток происходит обычно не более 3–4 циклов.

D — фаза замедления скорости роста (отрицательного ускорения)

длится около 2 ч. Количество питательных веществ существенно уменьшается (отмечается воздействие на бактерии лимитирующих факторов), в культуральной жидкости накапливаются метаболиты, в т. ч. токсичные для бактерий (отмечается ингибирующее воздействие) и скорость деления клеток снижается.

E — стационарная фаза, или фаза максимальной концентрации (М-кон-

центрация). Клетки перестают делиться. Однако количество живых клеток постоянно, т. к. количество жизнеспособных бактерий соизмеримо с количеством

108