2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Микробиология от Насти

Б) Мозговая среда. Состав – свежий мозг крс(не позже 18 часов),очищают от оболочек и измельчают на мясорубке - смешивают с водой 2 : 1 и пропускают через сито - смесь разливают по пробиркам и стерилизуют 2 часа при t=110

2. Плотные питательные среды. А)Кровяной сахарный агар цейсмера используют для выделения чистой культуры и определения характера роста. Пропись агара Цейсслера - 3% МПА разливают по 100мл. и стерилизуют - к расплавленному агару добавляют стерильно! 10 мл. 20% глюкозы (т. с. 2%)и 15-20 мл.стерильной крови барана, крс, лошади - Подсушивают Б) желатина - столбиком Для определения вида анаэробов необходимо изучать такие их признаки:

Морфологические, культуральные, патологические и серологические с учетом их возможностей к изменчивости.

Билет 12 1. Капсула бактерий, условия образования, химическая природа, значение, методы выявления. (10)

Капсула – поверхностная слизистая структура толщиной более 0,2 мкм, прочно связанная с КС и имеющая четкие границы. Состоит из экзополисахаридов (пневмококки), могут содержать полипептиды (сибиреязвенные бациллы). Мукоидные экзополисахариды характерны для мукоидных штаммов синегнойной палочки. Экзополисахариды (гликокаликс) участвуют в адгезии. В зависимости от выраженности выделяют:

-макрокапсулу (от 0,2 мкм) – имеет диаметр больше, чем у клетки, прочно с ней связана; образуется при неблагоприятных условиях; видна в световой микроскоп при окраске по Бурри-Гинсу;

-микрокапсулу (до 0,2 мкм) – имеется у многих бактерий, выявляется в электронном микроскопе;

-слизистый чехол – не имеет четких границ и легко отделяется от клетки.

Капсулу патогенные бактерии (пневмококки, бациллы и др.) образуют в организме или при культивировании, у некоторых видов (клебсиелла пневмонии) капсула обнаруживается постоянно.

Функции:

·защита от механических и температурных воздействий, факторов макроорганизма, фагов;

·запас некоторых питательных в-в;

·участие в адгезии;

41

·фактор патогенности, подавляет фагоцитоз (из-за гидрофильности);

·определение антигенной специфичности (К-антиген);

·экранирование бактериальных структур, активирующих систему комплемента, и распознаваемых иммунокомпетентными клетками;

·защита от действия лизосомальных ферментов и токсичных пероксидов фагоцитов.

Капсулы имеют консистенцию геля и не задерживают анилиновые красители. Капсула различима в мазках-отпечатках из патологического материала. Выявляется при окрашивании по Бурри-Гинсу и при применении противокапсульных сывороток.

2. Нормальная микрофлора и ее роль для организма человека. Понятие о резидентной и транзиторной микрофлоре. (50)

Нормальная микрофлора человека – это совокупность множества микробиоценозов. В организме человека формируются биотопы с определенными микробиоценозами. Любой микробиоценоз – это сообщество микроорганизмов, существующее как единое целое, связанное цепями питания и микроэкологией.

Виды нормальной микрофлоры:

1)резидентная – постоянная, характерная для данного вида;

2)транзиторная – временно попавшая, нехарактерная для данного биотопа; она активно не размножается.

Нормальная микрофлора формируется с рождения. На ее формирование оказывают влияние микрофлора матери и внутрибольничной среды, характер вскармливания.

Факторы, влияющие на состояние нормальной микрофлоры.

1. Эндогенные: 1) секреторная функция организма; 2) гормональный фон; 3) кислотно-основное состояние.

2. Экзогенные условия жизни (климатические, бытовые, экологические).

В организме человека стерильными являются кровь, ликвор, суставная жидкость, плевральная жидкость, лимфа грудного протока, внутренние органы: сердце, мозг, паренхима печени, почек, селезенки, матка, мочевой пузырь, альвеолы легких. Нормальная микрофлора выстилает слизистые оболочки в виде биопленки. В нем находятся микроколонии клеток нормальной микрофлоры. Формирование биопленки для бактерий создает дополнительную защиту.

Этапы формирования нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта (ЖКТ):

1)случайное обсеменение слизистой. В ЖКТ попадают лактобациллы, клостридии, бифидобактерии, микрококки, стафилококки, энтерококки, кишечная палочка и др.;

2)формирование сети из ленточных бактерий на поверхности ворсинок. На ней фиксируются в основном палочковидные бактерии, постоянно идет процесс формирования биопленки. Микрофлора кожи. Основные представители: коринеформные бактерии, плесневые грибы, спорообразующие аэробные палочки (бациллы), эпидермальные стафилококки, микрококки, стрептококки и дрожжеподобные грибы рода Malas-sezia.

Коринеформные бактерии представлены грамположительными палочками, не образующими спор. Аэробные коринеформные бактерии рода Corynebacterium обнаруживаются в кожных складках - подмышечных впадинах, промежности.

Анаэробные коринеформные бактерии представлены прежде всего видом Propionibacterium acnes - на крыльях носа, головы, спины (сальные железы).

Микрофлора верхних дыхательных путей. Здесь растут бактероиды, коринеформные бактерии, гемофильные палочки, лактобактерии, стафилококки, стрептококки, нейссерии, пептококки, пептострептококки и др. На слизистых оболочках респираторного тракта больше всего микроорганизмов в области носоглотки до надгортанника. В носовых ходах микрофлора представлена коринебактериями, постоянно присутствуют стафилококки (резидентные S. epidermidis), встречаются также непатогенные нейссерии, гемофильные палочки. Гортань, трахея, бронхи и альвеолы обычно стерильны.

Микрофлора мочеполового тракта. Почки, мочеточники, мочевой пузырь обычно стерильны. В уретре встречаются коринеформные бактерии, эпидермальный стафилококк, сапрофитные микобактерии (M. smegmatis), неклостридиальные анаэробы (превотеллы, порфиромонады), энтерококки. Основными представителями микрофлоры влагалища у женщин репродуктивного возраста являются лактобактерии. Колонизация влагалища лактобактериями обусловлена высоким уровнем эстрогенов у женщин детородного возраста. Эстрогены индуцируют накопление в вагинальном

42

эпителии гликогена, являющегося субстратом для лактобактерий. Лактобактерии расщепляют гликоген с образованием молочной кислоты, которая поддерживает рН влагалища на низком уровне (4,4-4,6) и является важнейшим контролирующим механизмом, препятствующим колонизации патогенными бактериями этой экологической ниши. Продукция перекиси водорода, лизоцима, лактацинов способствует поддержанию колонизационной резистентности.

Нормальная микрофлора влагалища включает бифидобактерии (встречаются редко), пептострептококки, пропионибактерии, превотеллы, бактероиды, порфиромонасы, коринеформные бактерии, коагулазоотрицательные стафилококки.

На состав микрофлоры влагалища оказывают влияние беременность, роды, возраст. Во время беременности количество лактобактерий повышается и достигает максимума в III триместре беременности. Доминирование лактобактерий у беременных снижает риск патологической колонизации при прохождении его через родовые пути.

Роды приводят к резким изменениям в составе микрофлоры влагалища. Снижается количество лактобактерий и существенно увеличивается количество бактероидов, эшерихий.

После наступления менопаузы в генитальном тракте снижаются уровни эстрогенов и гликогена, уменьшается количество лактобактерий, преобладают анаэробные бактерии, рН приобретает нейтральное значение. Полость матки в норме стерильна.

3. Гонококки. Таксономия и биологическая характеристика. Эпидемиология и патогенез заболеваний. Роль в патологии человека. Микробиологическая диагностика гонореи. Лечение. (108)

Гонококки относятся к виду Neisseria gonorrhoeae; вызывают антропонозное инфекционное заболевание, которое передается половым путем и характеризуется гнойным воспалением слизистых оболочек органов

мочеполовой системы (гонорея), а также острым гнойным воспалением слизистой глаза (бленнорея).

Морфология. Гонококки — грамотрицательные диплококки, спор не образуют, имеют пили. Культуральные свойства. Аэробы, хемоорганотрофы; обязательно добавление сыворотки или крови; растут на средах с добавлением асцитической жидкости или аминокислот (аргинин и другие добавки). Оптимум роста наблюдается при температуре 36–37 qС, рН 7,3–7,4 и повышенном содержании СО2. Биохимические свойства. Гонококки биохимически малоактивны; окисляют только глюкозу. Антигенная структура. Основными антигенами гонококков являются пили, окружающие поверхность бактерии, состоящие из белка пилина.

Факторы патогенности гонококков включают пили и компоненты наружной мембраны клеточной стенки. Пили инициируют адгезию (прикрепление)

гонококков к клеткам макроорганизма.

Они ингибируют фагоцитоз нейтрофилами, участвуют в обмене генетическим материалом между отдельными особями.

-Пориновые белки Por, или протеин I, препятствуют слиянию лизосом с фагосомой, способствуя тем самым внутриклеточному выживанию гонококков. -Оpa-белки (от англ. opacity — мутность), или протеин II, усиливают адгезию гонококков к клеткам макроорганизма.

-Протеин III блокирует антибактериальное действие сыворотки. -Липоолигосахарид наружной мембраны обладает свойствами эндотоксина — вызывает повреждение клеток и воспалительную реакцию ткани.

-IgA-протеазы разрушают секреторный иммуноглобулин слизистых оболочек. Резистентность. Гонококки высокочувствительны к высушиванию, солнечным лучам, дезинфицирующим средствам и другим физико-химическим факторам, что следует учитывать при заборе и транспортировке клинического материала.

Эпидемиология. человек, являющегося единственным источником заражения, сопровождающегося заболеванием. Входные ворота чаще всего слизистые оболочки, выстланные цилиндрическим эпителием (слизистые мочеполового тракта, глаза). Встречаются аноректальные и орофарингеальные формы гонореи.

Механизм передачи — контактный, путь — половой, при бленнорее — путем контакта конъюнктивы глаза новорожденного с инфицированной слизистой оболочкой половых путей матери.

Патогенез. гонококки освобождают липоолигосахарид и образуют ферменты, В очаг инфекции привлекаются нейтрофилы, что приводит образованию гнойного отделяемого. Гонококки способны

43

проникать в кровь и вызывать инфекцию с поражением суставов, мягких мозговых оболочек и других органов.

Клиника. Гонококковая инфекция проявляется в виде гнойного воспаления слизистой оболочки мочеполовых путей (гонорея), конъюнктивы глаз (бленнорея), других органов. Заболевание характеризуется резью при мочеиспускании, выделением гноя из уретры.

У мужчин в виде гонорейного уретрита, после которого. У женщин имеет бессимптомное течение, часто протекает в виде смешанной инфекции. Частое осложнение у женщин — бесплодие.

Очень редки генерализованные формы гонорейной инфекции: артриты, эндокардиты, менингиты. Иммунитет. не формируется.

Микробиологическая диагностика.

Бактериоскопическое исследование: Материалом для исследования служит гнойное отделяемое из уретры, влагалища, примой кишки, глотки, сыворотки крови. Готовят мазки, окраска по Граму, При «+» результате – обнаруживают гонококки – грам+ диплококки бобовидной формы., находятся внутри лейкоцитов. Положительный диагноз ставится при острой форме гонореи до применения антибиотиков. Бактериологическое исследование. Материал засевают на чашки Петри со специальными питательными средами — КДС, сывороточным агаром. Среда КДС содержит питательный агар с добавлением в определенной концентрации казеина, дрожжевого экстракта и сыворотки крови. Посевы инкубируют при 37°С в течение 24—72 ч. Гонококки образуют круглые прозрачные колонии, напоминающие капли росы, в отличие от более мутных колоний стрептококков или пигментированных колоний стафилококков, которые также могут расти на этих средах. Подозрительные колонии пересевают в пробирки на соответствующие среды для получения чистых культур, которые идентифицируют по сахаролитическим свойствам на средах «пестрого» ряда (полужидкий агар с сывороткой и углеводом). Гонококк ферментирует только глюкозу с образованием кислоты.

Серодиагностика. В некоторых случаях ставят РСК Борде — Жангу. В качестве антигена используют взвесь убитых гонококков. Реакция Борде—Жангу имеет вспомогательное значение при диагностике гонореи. Она положительна при хронической и осложненной гонорее.

Лечение. Обычно применяют цефалоспорины, фторхинолоны и др. При хронической гонорее применяют иммунотерапию в виде убитой гоновакцины.

Профилактика. специфическая профилактика не разработана. Должна соблюдаться неспецифическая профилактика: исключение случайных половых связей, контроль за излеченностью больных, использование презервативов, санитарно-просветительная работа и т.п.

4. Реакция иммунофлюоресценции (МФА). Механизм, компоненты, применение. (87)

Реакция иммунофлюоресценции - РИФ (метод Кунса).

Различают три разновидности метода прямой, непрямой, с комплементом. Реакция Кунса является методом экспресс-диагностики для выявления антигенов микробов или определения антител. Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах

люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета.

Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген - антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.

44

Билет 13 1. Споры бактерий, строение, условия образования, значение и методы выявления. (14)

М/о существуют в вегетативных и покоящихся формах.

Вегетативные формы м/о активно растут и размножаются, покоящиеся – жизнеспособны, но их метаболизм резко замедлен.

К покоящимся формам относят:

·споры – бактерии и грибы; · цисты – спирохеты и простейшие; · малые формы (риккетсии) и элементарные тельца (хламидии); · вирионы, лизогенные формы – вирусы; · L-формы – бактерии (могут размножаться).

Для них характерно:

·толстая, малопроницаемая оболочка;

·небольшое содержание воды;

·отсутствие роста, размножения, выделения ферментов и токсинов;

·высокая резистентность к повреждающим факторам;

·способность долго сохраняться во внешней среде или организме.

Споры — покоящаяся форма грам(+) бактерий. Образуются при неблагоприятных условиях (высушивание, УФ-облучение, дефицит питательных веществ и др.). Образование спор способствует сохранению вида (не является способом размножения, как у грибов). Внутри бактериальной клетки образуется одна эндоспора. Экзоспоры образуются вне клетки (способ размножения актиномицет).

Спорообразующие аэробные бактерии, не раздувающиеся при спорообразовании, называются бациллами. Спорообразующие бактерии, у которых споры больше клетки, лимоновидной формы, называются клостридиями.

Форма спор может быть овальной, шаровидной; расположение в клетке — терминальное, т.е. на конце палочки (у возбудителя столбняка), субтерминальное — ближе к концу палочки (у возбудителей ботулизма, газовой гангрены) и центральное (у сибиреязвенной бациллы).

Строение:

·проспора (содержит ЦПМ, цитоплазму, хромосому, все компоненты белоксинтезирующей системы и анаэробной энергообразующей системы);

·Многослойная плохо проницаемая оболочка:

·ЦПМ (внутренняя мембрана);

·зачаточный слой КС;

·кортекс (пептидогликановый слой);

·ЦПМ (наружная мембрана);

·подпокровный слой цитоплазмы;

·внутренняя оболочка (пептидогликан);

·наружная оболочка (кератиноподобный белок);

·экзоспореальная цитоплазма;

·экзоспориум (липопротеиновая оболочка, содержащая немного углеводов).

Спорообразование (споруляция) проходит в 5 стадий: Спорообразование сопровождается интенсивным потреблением проспорой и оболочкой дипиколиновой кислоты и ионов кальция.

В благоприятных условиях споры прорастают, проходя три стадии: активацию (готовность к прорастанию), инициацию, вырастание (быстрый рост, разрушение оболочки и выход проростка). Из одной споры образуется одна бактерия. Прорастание споры происходит в течение 4-5 ч, в то время как

45

образование споры продолжается 18-20 ч. Споры можно выявить при обычном окрашивании бактерии в виде не окрашенной области внутри клетки. Споры кислотоустойчивы, окрашиваются по методу Ожешки или по Цилю—Нельсену в красный, а вегетативная клетка — в синий, выявляются фазовоконтрастной и электронной микроскопией.

2. Понятие о химиотерапии. История открытия пенициллина. (53)

Химиотерапия — специфическое антимикробное, антипаразитарное лечение при помощи химических веществ. Основоположником химиотерапии является П.Эрлих, который установил, что химические вещества, содержащие мышьяк, губительно действуют на спирохеты и трипаносомы, и получил в 1910 г. первый химиотерапевтический препарат — сальварсан (соединение мышьяка, убивающее возбудителя, но безвредное для микроорганизма).

В1935 г. другой немецкий химик Г.Домагк обнаружил среди анилиновых красителей вещество — пронтозил, или красный стрептоцид, спасавший экспериментальных животных от стрептококковой инфекции, но не действующий на эти бактерии вне организма. Позднее было выяснено, что в организме происходит распад пронтозила с образованием сульфаниламида, обладающего антибактериальной активностью как in vivo, так и in vitro.

Механизм действия сульфаниламидов (сульфонамидов) на микроорганизмы был открыт Р.Вудсом, установившим, что сульфаниламиды являются структурными аналогами парааминобензойной кислоты (ПАБК), участвующей в биосинтезе фолиевой кислоты, необходимой для жизнедеятельности бактерий. Бактерии, используя сульфаниламид вместо ПАБК, погибают. Первый природный антибиотик был открыт в 1929 г. английским бактериологом А.Флемингом.

При изучении плесневого гриба Penicillium notatum, препятствующего росту бактериальной культуры, А. Флеминг обнаружил вещество, задерживающее рост бактерий, и назвал его пенициллином.

В1940 г. Г. Флори и Э. Чейн получили очищенный пенициллин. В настоящее время имеется огромное количество химиотерапевтических препаратов, которые применяются для лечения заболеваний, вызванных различными микроорганизмами.

3. Возбудитель чумы. Таксономия и биологическая характеристика. Эпидемиология и патогенез заболеваний. Микробиологическая диагностика. Специфическая профилактика и лечение. Особенность эпиднадзора чумы в Волгоградской области. (112)

1.Таксономия Род Yersinia содержит 7 видов, среди которых Yersinla pestis – возбудитель чумы.

2.Основные биологические свойства:

Морфологические – грамотрицательные, полиморфные мелкие, неподвижные палочки с закругленными концами (английская булавка). Спор не образуют. В организме больного и при размножении на специальных средах образуют капсулу (имеет нежную капсулу.). Характерной морфологической особенностью является овоидная форма микроба и биполярная окрашиваемость, когда средняя часть клетки почти не окрашивается, а концы окрашены интенсивно. Культуральные: палочки чумы – факультативные анаэробы размножаются на простых питательных средах. Оптимальная температура для их роста 25-30 градусов, но может расти в широком диапозоне

температур от 2 до 40 °С. Для ускорения роста в питательные среды добавляют стимуляторы, сульфит натрия и гемолизированную кровь.В жидких питательных средах палочки чумы образуют пленку на поверхности, от которой опускаются вниз нити (пещерные сталактиты; на дне образуется хлопьевидный осадок). На плотных средах образуют через 8—12 ч появляются колонии в виде битого стекла; через 18—20 ч инкубации шероховатые R – формы колонии с неровным краем―кружевной платочек. Биохимические: сбраживают некоторые углеводы с образованием кислоты.

не ферментируют рамнозу, сахарозу, не расщепляют мочевину, ферментирует декстрин. По отношению к утилизации глицерина подразделяется на хемовары.

46

Антигенные свойства: Имеет термостабильный О-антиген и термолабильный капсульный антигены. Протективной активностью обладает Fl-антиген и LCR-Ьепок. Имеет антигены, общие с антигенами эритроцитов 0-группы крови человека Патогенность: обладает многочисленными факторами патогенности, генетическая детерминация

которых осуществляется как хромосомой, так и тремя плазмидами. Плазмида pYV детерминирует синтез ТТСС (Ysc-Yups), эффекторные белки которой обладают антифагоцитарной активностью. Антифагоцитарная активность обеспечивается также факторами патогенности, гены которых имеют хромосомную локализацию: внеклеточной аденилатциклазой, супероксиддисмутазой и белком рН6. Крупная плазмида pFra детерминирует синтез Fl-антигена, капсульного белка, препятствующего поглощению микроба фагоцитами, и Р2-фракции мышиного токсина, который не играет роли в патогенезе чумы у людей, но необходим в процессе колонизации кишечника блохи.

Синтез ферментов патогенности: плазмокоагулазы (активирующей плазминоген протеазу), обеспечивающую резистентность к действию комплемента, фибринолизина и пестицина, — регулируется малой плазмидой pPst.

Резистентность. Микроб обладает психрофильностью

Этиопатогенез чумы, клинические формы.

1) кожно-бубонная, 2) первично – и вторично –септическая, 3) первично – и вторично легочная, 4) кишечная.

Чума- природно-очаговые инфекции.Природные очаги в России регионы Закавказья и Поволжья.Основными носителями возбудителя чумы в природных очагах являются грызуны.Специфическими переносчиками в обоих типах очагов служат блохи вида Xenopsylla cheopsis. В инфицированной блохе возбудитель размножается в преджелудке, а при кровососании человека попадает в его кровь.

Источник инфекции – человек может заражаться:

•в очаге трансмиссивно через укусы инфицированных блох вида Xenopsylla cheopsis;

•при контакте с инфицированными животными (разделка шкур и мяса зараженных животных);

•алиментарным путем (редко) при употреблении в пищу продуктов, обсемененных чумным микробом;

•аэрогенно от больного с легочной формой чумы.

Путь передачи – контактный, трансмиссивный (переносчики блохи), алиментарный, воздушнокапельный.

Клиническая картина – Инкубационный период 3— 7 дней. Заболевание характеризуется острым началом, лихорадкой, ознобом, сильной головной болью, тошнотой и рвотой. Клинические проявления зависят от способа заражения. Различают бубонную, септическую и легочную формы. Редко встречаются кожная и кишечная формы заболевания.При прогрессировали заболевания у больного развивается помрачение сознания, он может впасть в кому. При нелеченой бубонной форме летальность составляет около 60%, нелеченая легочная форма характеризуется высокой — до 95—100% — летальностью.

Патогенез Бубонная форма возникает при укусе блох и прямом контакте с зараженным животным. От места

внедрения возбудитель с током лимфы заносится в регионарные лимфатические узлы, где происходит его интенсивное размножение. В результате незавершенности фагоцитоза в лимфатических узлах развивается серозно-геморрагическое воспаление с образованием увеличенного в размерах очень болезненного лимфатического узла — бубона. Вследствие утраты лимфатическим узлом барьерной функции микроб попадает в кровяное русло и разносится кровью по организму, поражая другие лимфатические узлы с развитием вторичной бубонной формы, а также различные органы и ткани, где формируются септико-пиемические очаги.

Септическая форма заболевания может развиться непосредственно после укуса блохи или прямого контакта с инфицированным материалом. Наиболее тяжелой является легочная форма заболевания, которая может возникнуть как и результате гематогенного заноса в легкие возбудителя из бубона, так и при аэрогенном заражении от больного с легочной формой чумы или в результате использования возбудителя в качестве агента биологического терроризма.

При легочной форме развивается пневмония, сопровождающаяся серозно-геморрагическим экссудатом, содержащим большое число микробов, «кровавым» кашлем и легочной недостаточностью. Материал для диагностики Гной из бубонов, язв, соскоб кожных элементов, пунктат лимфатических узлов, мокрота, слизь из зева, кровь, промывные воды желудка, секционный материал (паренхиматозные органы, лимфатические узлы). Материал доставляют с нарочным.

47

Бактериоскопический метод Из исследуемого материала готовят мазки, окрашивают: 1.по Граму. Грамотрицательные овоидные палочки, спор не образуют. В мазках биоптатов располагаются вне- и внутриклеточно.

2.метиленовым синим – биполярность окраскиярче окраска по полюсам клетки.

3.МФА – мазок окрашивают люминесцентной противочумной сывороткой – видны светящиеся бактерии.

Бактериологический метод.

1 день 1. Посев на агар Хоттингира с генцианвиолетом (ингибитор посторонней споровой флоры) и сульфитом натрия (стимулятор роста)- среда Туманского; 2. МПА; 3.МПБ; Инкубируют 28С 2 суток 3 день Рост колоний в R – форме:

-через 12 часов –«битое стекло», смотрят под малым увеличением микроскопа;

-через 24 часа - «кружевной платочек»;

-через 48 часов – зрелые колонии коричневого цвета.

Иерсинии чумы ферментируют углеводы только до кислоты, индола не образуют, желатин не расщепляют, лизируя чумным бактериофагом агглютинируются диагностическими, иммунными противочумными сыворотками Биологический Исследуемым материалом заражают морских свинок путем втирания в кожу живота.На

3-7 день морская свинка погибает, ее вскрывают и делают мазки – отпечатки из паренхиматозных органов

Экспресс – методы лабораторной диагностики.

1.Имуннофлюоресцентный метод Исследуемый материал наносят на предметное стекло, обрабатывают люминисцентной противочумной сывороткой и учитывают результат с помощью люминисцентного микроскопа.На темном фоне зеленое свечение возбудителя чумы.

2.РПГА (реакция пассивной гемагглютинации) применяется для обнаружения антигенов бактерий чумы в исследуемом материале с помощью стандартной противочумной сыворотки, антитела которой нагружены на эритроцитах.Если реакция положительная, эритроциты склеятся и выпадут в осадок в виде ―зонтика. При отрицательной реакции эритроциты оседают на дно в виде ―пуговки. Специфическая профилактика осуществляется живой вакциной из штамма EV. Поствакцинальный иммунитет непродолжительный, около 6 мес. Вакцина вводится однократно накожно или подкожно. Для массовой иммунизации вакцина вводится при помощи безыгольного инжектора. Имеется таблетированная форма вакцины из штамма EV для перорального применения (А.А. Воробьев, Е.М. Земсков).

4. Аллергологический метод исследования. Клинико-диагностическое значение гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). Постановка и оценка аллергической пробы на примере реакции Манту. (77)

Антигены возбудителей способны вызывать аллергические реакции. Наибольшее распространение нашли кожно-аллергические пробы, включающие внутрикожное введение Аг (аллергена).

Проба Манту, используемая как для диагностики туберкулёза, так и для оценки невосприимчивости организма к возбудителю.

Была выделена гиперчувствительность немедленного типа (ГНТ) и гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ).

Реакции ГЗТ возникают через 6-8 ч и позже. ГЗТ опосредована клеточным звеном иммунитета. Специфическая терапия, как правило, оказывается неэффективной.

4 основных типа аллергии:

анафилактический (I тип), цитотоксический (II тип), иммунокомплексный (III тип) и опосредованный клетками (IV тип).

Первые три типа относятся к ГНТ, четвертый к ГЗТ.

ГЗТ представляет собой лимфоидно-макрофагальную реакцию, которая развивается в результате активации макрофагов под влиянием лимфоцитов, сенсибилизированных к аллергену. Активация макрофага возможна в результате контактного воздействия.

Контактная стимуляция - результат взаимодействия макрофага, несущего рецепторную молекулу СD40, и Т1-хелпера, экспрессирующего СD40-лиганд. В исключительных случаях эту функцию может выполнять Т2хелпер. Цитокиновая активация макрофага осуществляется γ-ИФН, который продуцируют Т1хелперы, Т-киллеры или естественные киллеры. Кроме того, макрофаг может быть стимулирован ЛПС (через СD14-рецепторную молекулу).

Ингибиторами активации макрофага являются иммуноцитокины Т2хелпера: ИЛ-4, 10, 13 и др.

48

Для обнаружения аллергических реакций IV типа применяют кожно-аллергические пробы.

Аллергические пробы - биологические реакции для диагностики ряда заболеваний, основанные на повышенной чувствительности организма, вызванной аллергеном. На этом основаны аллергические пробы, используемые для диагностики бактериальных, вирусных, протозойных инфекций, микозов и гельминтозов.

Все аллергические пробы подразделяют на две группы — пробы in vivo и in vitro.

Кпервой группе (in vivo) относятся кожные пробы, осуществляемые непосредственно на пациенте и выявляющие аллергию немедленного (через 20 мин) и замедленного (через 24 — 48 ч) типов. Аллергические пробы in vitro основаны на выявлении сенсибилизации вне организма больного. Их применяют тогда, когда по тем или иным причинам нельзя произвести кожные пробы, либо в тех случаях, когда кожные реакции дают неясные результаты.

Для проведения аллергических проб используют аллергены — диагностические препараты,

предназначенные для выявления специфической сенсибилизации организма. Представляют собой очищенные фильтраты бульонных культур, реже взвеси убитых микроорганизмов или АГ, выделенные из них.

Кожные пробы. Инфекционные аллергены вводят, внутрикожно или накожно, путем втирания в скарифицированные участки кожи. Через 28 — 48 ч оценивают результаты реакции ГЗТ, определяя на месте введения размеры папулы.

Неинфекционные аллергены (пыльца растений, бытовая пыль, пищевые продукты, лекарственные и химические препараты) вводят в кожу уколом (прик-тест), накожно путем скарификации и втирания или внутрикожной инъекцией разведенного раствора аллергена. В качестве отрицательного контроля используют ИХН, в качестве положительного — раствор гистамина. Результаты учитывают в течение 20 мин (ГНТ) по величине папулы (иногда до 20 мм в диаметре), наличию отека и зуда.

Внутрикожные пробы ставят в случае отрицательного или сомнительного результата прик-теста.

Кожные пробы на наличие ГЗТ широко применяют для выявления инфицированности людей микобактериями туберкулеза (проба Манту), возбудителями бруцеллеза (проба Бюрне), лепры (реакция Митсуды), туляремии, сапа, актиномикоза, дерматомикозов, токсоплазмоза, некоторых гельминтозов и др.

Пробы in vitro. Позволяют количественно оценить уровень аллергизации организма. Тесты для определения сенсибилизации, основанные на реакциях Т- и B-лимфоцитов, тканевых базофилов, выявлении общих специфических IgE в сыворотке крови и др.

Кним относятся реакции торможения миграции лейкоцитов и бласттрансформации лимфоцитов, специфическое розеткообразование, базофильный тест Шелли, реакция дегрануляции тканевых базофилов, а также аллергосорбентные методы (определение специфических IgE в сыворотке крови).

Реакция торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ). РТМЛ основана на подавлении миграции моноцитов и других лейкоцитов под действием медиаторов, вырабатываемых сенсибилизированными лимфоцитами, в присутствии специфического аллергена.

Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТ). В основе этой реакции лежит способность нормальных лимфоцитов периферической крови вступать в митоз и превращаться в бластные формы при культивировании их in vitro под действием специфических факторов — аллергенов и неспецифических стимуляторов митогенеза — митогенов (фитогемагглютинин, конканавалин А, липополисахариды и другие вещества).

Реакция специфического розеткообразования. Розетки — характерные образования, возникающие in vitro в результате прилипания эритроцитов к поверхности иммунокомпетентных клеток. Розеткообразование может происходить спонтанно. Спонтанное розеткообразование здоровых людей составляет 52 — 53% и служит показателем функционального состояния Т-лимфоцитов.

Реакция дегрануляции тканевых базофилов. Методика основана на том, что под действием аллергена происходит дегрануляция тканевых базофилов крысы, предварительно сенсибилизированных цитофильными AT из сыворотки крови больного.

Базофильный тест Шелли. Известно, что базофильные гранулоциты человека или кролика также дегранулируются в присутствии сыворотки больного и аллергена, к которому чувствителен данный пациент.

Определение антител класса IgE in vitro. Лабораторная диагностика заболеваний, в основе которых лежит ГНТ, основана на определении аллергенспецифических IgEанти-IgE. При использовании радиоактивной метки метод носит название радиоаллергосорбентного теста (PACT), но чаще в качестве метки используют фермент или флюоресцирующее вещество (ФАСТ). Время анализа — 6 — 7 часов.

49

Техника постановки реакции Манту, оценка результатов.

Цель: диагностика. Показания: отбор детей, подлежащих прививке ВСG, определение инфицированности детей микобактериями туберкулеза, раннее выявление туберкулеза у детей и подростков. Противопоказания: 1. Обострение кожных проявлений экссудативно-катарального диатеза. 2. Эпилепсия 3. Острые и хронические инфекционные и соматические заболевания в период обострения 4. Аллергические состояния.

Оснащение: 1. Стерильный столик со стерильным материалом, стерильный пинцет. 2. Перчатки стерильные 3. Стандартный туберкулин 4. Мензурка для помещения в нее ампулы 5. Туберкулиновый шприц 6. Лоток с дезраствором для сбрасывания шприцов 7. Емкость с дезраствором для отработанного материала 8. 70% этиловый спирт 9. Стерильный лоток 10. Наждачный диск.

Обязательные условия: 1. хранение туберкулина в холодильнике при температуре +2 +8 градусов 2. не допускается замораживание препарата и перегревания свыше 18 градусов 3. вскрытая ампула подлежит хранению в асептических условиях не более 2 часов 4. проба выполняется внутрикожно на предплечье:

в четные годы - на правом, в нечетные – на левом 5. предупредить родителей или ребенка, что нельзя мыть, заклеивать, расчесывать место инъекции 3 дня.