2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Микробиология от Насти
.pdfОбразовавшийся на полоске комплекс [антиген + антитело больного + антитело против Ig человека] выявляют добавлением хромогенного субстрата, изменяющего окраску под действием фермента.
Билет 10 1. Цитоплазма бактерий, состав, функции, методы изучения включений. (9)
Цитоплазма – полужидкое содержимое клетки (коллоид), ограниченное ЦПМ. Состав: 75% воды, минеральные в-ва, ферменты, белки, РНК, включения, рибосомы. Жидкая часть цитоплазмы – цитозоль. Функции: поддержание объёма и объединение компонентов клетки, обеспечение их взаимодействия.Выявляется электронной микроскопией.
Включения – необязательные компоненты клетки (зерна, капли, гранулы с химическими в-вами): полисахариды (гликоген и крахмал), липиды, полифосфаты (зерна волютина), минеральные вещества
(S, Ca, Fe).
Функции: трофическая и энергетическая. Зерна волютина выявляются световой микроскопией после окраски по Леффлеру (протоплазма голубая, валютин тёмно-синий), по Нейссеру (бактерии светлокоричневые, валютин тёмно-синий) и электронной микроскопией.
Толуидиновым синим и метиленовым голубым волютин окрашивается в красно-фиолетовый цвет, цитоплазма — в синий. Характерное расположение гранул волютина выявляется у дифтерийной палочки в виде интенсивно прокрашивающихся полюсов клетки.
Гликоген (у бацилл и дрожжей) обнаруживают при иммерсионной микроскопии, окрашивая I + KI (красно-бурый цвет).
2. Микробиоценоз пищеварительного тракта. Состав, характеристика, функциональное значение. (51)
Рот. В полости рта обитают многочисленные микроорганизмы. Этому способствуют остатки пищи во рту, благоприятная температура и щелочная реакция среды. Анаэробов больше, чем аэробов, в 10100 раз. Здесь обитают разнообразные бактерии: бактероиды, превотеллы, порфиромонады, бифидобактерии, эубактерии, фузобактерии, лактобактерии, актиномицеты, гемофильные палочки, лептотрихии, нейссерии, спирохеты, стрептококки, стафилококки, пептококки, пептострептококки, вейлонеллы и др.
Анаэробы обнаруживаются прежде всего в карманах десен и зубных бляшек. Они представлены родами
Bacteroides, Porphyromonas,Fusobacterium и др.
Аэробы представлены Micrococcus spp., Streptococcus spp. Обнаруживаются также грибы рода Candida и простейшие (Entamaeba gingivalis, Trichomonas tenax). Ассоцианты нормальной микрофлоры и продукты их жизнедеятельности образуют зубной налет.
Антимикробные компоненты слюны, особенно лизоцим, антимикробные пептиды, антитела (секреторный IgA), подавляют адгезию посторонних микробов к эпителиоцитам. С другой стороны бактерии образуют полисахариды: S. sanguis и S. mutans преобразовывают сахарозу во внеклеточный полисахарид (глюканы, декстраны), участвующие в адгезии к поверхности зубов.
Колонизации постоянной частью микрофлоры способствует фибронектин, покрывающий эпителиоциты слизистых оболочек (полный текст см. на диске). Пищевод практически не содержит микроорганизмов. Желудок. В желудке количество бактерий не превышает 105 КОЕ в 1 мл. Размножение микроорганизмов в желудке происходит медленно из-за кислого значения рН окружающей среды. Чаще всего встречаются лактобактерии, поскольку они устойчивы в кислой среде. Нередки и другие грамположительные бактерии: микрококки, стрептококки, бифидобактерии.
Тонкая кишка. Проксимальные отделы тонкой кишки содержат небольшое количество микроорганизмов - не превышает 103 -105 КОЕ/мл. Чаще всего встречаются лактобактерии, стрептококки и актиномицеты. Это обусловлено, низким значением рН желудка, характером нормальной двигательной активности кишечника, антибактериальными свойствами желчи. В дистальных отделах тонкой кишки количество микроорганизмов увеличивается, достигая 107 -108 КОЕ/г.
Толстая кишка. В дистальных отделах толстой кишки количество микроорганизмов достигает 1011 - 1012 КОЕ/г, а количество встречающихся видов достигает 500. Преобладающими микроорганизмами являются облигатные анаэробы, их содержание в этом отделе пищеварительного тракта превышает таковое аэробов в 1000 раз. Облигатная микрофлора представлена в основном бифидобактериями, эубактериями, лактобактериями, бактероидами, фузобактериями, пропионобактериями,
31
пептострептококками, пептококками, клостридиями, вейлонеллами. Все они высокочувствительны к действию кислорода.
Аэробные и факультативно анаэробные бактерии представлены энтеробактериями, энтерококками и стафилококками.
В пищеварительном тракте микроорганизмы локализуются на поверхности эпителиальных клеток, в глубоком слое мукозного геля крипт, в толще мукозного геля, покрывающего кишечный эпителий, в просвете кишечника и в бактериальной биопленке.
Микрофлора желудочно-кишечного тракта новорожденных.
Известно, что желудочно-кишечный тракт новорожденного стерилен, но уже через сутки начинает заселяться микроорганизмами, попадающими в организм ребенка от матери, медицинского персонала и окружающей среды.
Первичная колонизация кишечника новорожденного включает несколько фаз:
•1-я фаза - 10-20 ч после рождения - характеризуется отсутствием микроорганизмов в кишечнике (асептическая);
•2-я фаза - через 48 ч после рождения - общее количество бактерий достигает 109 и более в 1 г испражнений. Эта фаза характеризуется заселением кишечника лактобактериями, энтеробактериями, стафилококками, энтерококками, вслед за ними появляются анаэробы (бифидобактерии и бактероиды). Данный этап еще не сопровождается формированием постоянной флоры;
•3-я фаза - стабилизации - наступает, когда бифидофлора становится основной флорой микробного пейзажа. Преобладание бифидобактерий в кишечнике отмечается только на 9-10- е сутки жизни. Условно-патогенным группами являются лецитиназоположительные клостридии, коагулазоположительные стафилококки, грибы рода Candida, цитратассимилирующие энтеробактерии и эшерихии с низкой биохимической активностью, а также со способностью к продукции гемолизинов.
Характеристика основных представителей микрофлоры кишечника:
Бифидобактерии - грамположительные, неспорообразующие палочки, облигатные анаэробы. Преобладают в толстой кишке с первых дней и на протяжении всей жизни. Бифидобактерии выделяют большое количество кислых продуктов, бактериоцинов, лизоцима, что позволяет им поддерживать колонизационную резистентность, препятствовать транслокации условно-патогенных микроорганизмов.
Лактобактерии - грамположительные неспорообразующие палочки, микроарофилы. Являются представителями микрофлоры толстой кишки, полости рта и влагалища, обладают выраженной способностью к адгезии к эпителиоцитам кишечника, входят в состав мукозной флоры, участвуют в создании колонизационной резистентности, обладают иммуномодулирующим свойством, способствуют выработке секреторных иммуноглобулинов. Количество в большей степени зависит от вводимых кисломолочных продуктов и составляет 106 - 108 в 1 г.
Эубактерии - грамположительные неспорообразующие палочки, строгие анаэробы. У детей, находящихся на грудном вскармливании, встречаются нечасто. Принимают участие в деконъюгации желчных кислот.
Клостридии - грамположительные, спорообразующие палочки, строгие анаэробы. Лецитиназоотрицательные клостридии появляются у новорожденных уже в конце 1-й недели жизни,
а их концентрация достигает 106 -107КОЕ/г. Лецитиназоположительные клостридии (С рerfringens)
встречаются у 15% детей раннего возраста. Эти бактерии исчезают при достижении ребенком возраста
1,5-2 лет.
Бактероиды - грамотрицательные, неспорообразующие облигатно-анаэробные бактерии. Доминирующими в кишечнике ребенка эти бактерии становятся после 8- 10 мес жизни: их количество достигает 1010 КОЕ/г. Участвуют в деконъюгации желчных кислот, обладают иммуногенными свойствами, высокой сахаралитической активностью, способны расщеплять углеводсодержащие компоненты пищи, продуцируя большое количество энергии.
Факультативно анаэробные микроорганизмы:
Эшерихии - грамотрицательные палочки, появляются в первые дни жизни и сохраняются на протяжении всей жизни в количестве 107 -108 КОЕ/г. Составляют значительную часть как качественного, так и количественного состава энтеробактерий у детей первого года жизни, но в последующем к концу первого года жизни по мере созревания иммунной системы ребенка происходит частичная или полная элиминация условно-патогенных бактерий.
32
Стафилококки - грамположительные кокки, коагулазоотрицательные стафилококки колонизируют кишечник ребенка с первых дней жизни. Коагулазоположительные (S. aureus) в настоящее время обнаруживаются более чем у 50% детей в возрасте 6 мес и после 1,5-2 лет.
Стрептококки и энтерококки - грамположительные кокки. Заселяют кишечник с первых дней жизни, количество достаточно стабильное на протяжении жизни - 106 -107 КОЕ/г. Участвуют в создании колонизационной резистентности кишечника.
3. Менингококки. Таксономия и биологическая характеристика. Эпидемиология и патогенез заболеваний. Роль в патологии человека. Микробиологическая диагностика менингококковой инфекции. Лечение. (107)
Менингококки
Neisseria meningitides вызывает менингококковую инфекцию — острое
инфекционное заболевание человека, которое передается воздушно-капельным путем; характеризуется локальным поражением слизистой оболочки носоглотки с последующей генерализацией в воспаления мягких мозговых оболочек (менингококковый менингит).
Морфология. Менингококки — диплококки в виде кофейных зерен или фасоли. Они имеют пили, микрокапсулу, могут образовывать капсулу. Грамотрицательны.
Культуральные свойства. Аэробы . питательным средам: необходимо включение в них аминокислот в качестве источников углерода и азота. Оптимум для роста: рН 7,2–7,6, температура 37 qС. Биохимические свойства менингококков выражены слабо: расщепляют только глюкозу и мальтозу с образованием кислоты без газа.
Антигенная структура неоднородна: имеют родовой антиген (белки и полисахариды), а также видовой (протеиновый), групповые (полисахаридные капсульные) и типоспецифические антигены (белки наружной мембраны).
По капсульным антигенам различают 13 серогрупп менингококков, среди которых наибольшее значение в патологии человека имеют серогруппы A, B,
C, X, Y, W-135.
Факторы патогенности.
-эндотоксин (липоолигосахарид), ответственный за (кровоизлияния, кожные высыпания и др.); -капсула; -белки наружной мембраны и пили, усиливающие адгезию и инвазию возбудителя;
-IgA-протеазы, защищающие бактерию от действия антител. Резистентность. Менингококки чувствительны к различным физическим и химическим факторам, плохо переносят высушивание, мгновенно погибают
при кипячении. Чувствительны к большинству используемых в клинике антибиотиков, однако существуют и резистентные штаммы.
Эпидемиология. единственным источником инфекции служит человек.
Входные ворота и место обитания менингококков чаще всего носоглотка. Заражение в основном происходит аэрогенным механизмом, путь — воздушно-капельный.
Патогенез. В большинстве не возникает патологических явлений, формируется здоровое носительство. В других случаях появляются воспалительные изменения слизистой оболочки носоглотки — менингококковый назофарингит. В случае возбудитель попадает в кровь, развивается бактериемия (менингококцемия). может вызвать поражение мозговых оболочек и вещества мозга с развитием гнойного менингита или менингоэнцефалита.
Эндотоксин вызывает микроциркуляторные расстройства (спазм капилляров, нарушение их проницаемости). В случае массивной эндотоксемии возможно развитие эндотоксического шока.
Клиника. Различают менингококконосительство, локализованные формы менингококковой инфекции — острый назофарингит, а также генерализованные
формы (бактериемия и цереброспинальный эпидемический менингит). Наиболее тяжелые формы: бактериемия, сопровождающаяся высокой температурой, геморрагическими высыпаниями (петехиями); менингит, развивающийся внезапно, с сильной головной болью, рвотой, ригидностью мышц шеи и другими симптомами.
33
Иммунитет. развивается приобретенный антибактериальный группоспецифический иммунитет. Человек обладает и стойким врожденным иммунитетом в отношении менингококков. Менингитом чаще заболевают дети (в возрасте от 6 мес. до 10 лет), у которых отмечается низкий уровень антител.
Микробиологическая диагностика.
Материал для диагностики СМЖ, кровь, питехии, отделяемое носоглотки. Материал отбирают специальным носоглоточным тампоном (на 3/4 длины согнутый под углом 45°). материал предохраняют от охлаждения (доставляют с сумках – термостатах с грелкой).
Бактериоскопический метод.
1.По Граму, метиленовым синим. В мазках крови, питехий, отделяемого носоглотки - Гр (-) одиночные кокки или диплококки. В СМЖ - диплококки, расположенные в лейкоцитах (незавершенный фагоцитоз).
2.МФА.
Бактериологический метод.
-1 день (1 этап). Посев материала тампоном на кровяной агар (КА) и сывороточный агар (СА) с антибиотиком, подавляющим рост гр (+) бактерий (линкомицин). Инкубируют при 37ºС 18 - 48 часов, при повышенном содержании СО2 (сосуд со свечой).
-2 день (2 этап) Изучают культуральные свойства бактерий. На КА: белые, круглые, диаметром 2 мм колонии. Учитывают количество выросших колоний. Отмечают отсутствие гемолиза вокруг колонии. На СА: рост круглых, прозрачных колоний с голубоватым оттенком. Бактериоскопия: ½ часть подозрительной колонии окрашивают по Граму: Гр (-) диплококки в виде кофейных зерен. Оставшуюся часть агглютинируют с антисыворотками групп А, В, С в реакции агглютинации на стекле. Получение чистой культуры для изучения биохимических свойств: Отсевают на скошенный СА или КА. Инкубируют при 37ºС 18 -24 часа.
-3 день (3 этап) 1. Проводят видовую идентификацию микроорганизма. Изучение биохимических свойств: Со скошенного КА или СА ставят пробы: - рост на МПА при 37°С; - рост на СА при 22ºС; - рост на СА при 37ºС; - проба на оксидазу; - проба на каталазу; Определяют чувствительность к антибиотикам. Инкубируют при 37ºС 18 -24 часа. 14
-4 день (4 этап) Проводят учет результатов: - отсутствие роста на МПА при 37°С; - отсутствие роста на СА при 22ºС - наличие роста на СА при 37ºС; - оксидаза (+); - каталаза (+); Положительный ответ выдают при положительной РА на стекле с менингококковыми сыворотками групп А, В, С.
Серологический метод. РПГА для выявления титра антител в сыворотке больных. Используются эритроцитарные антигенные (из капсульного полисахарида) диагностикумы группы А, группы В, группы С.
ПЦР – диагностика. Обнаруживают ДНК возбудителя: - в исследуемом образце материала; - в выделенной чистой культуре Лечение. Антибиотики выбора — пенициллины, цефалоспорины третьего
поколения (цефотаксим, цефтриаксон), ципрофлоксацин и др. Профилактика. Неспецифическая профилактика направлена на изоляцию больных и носителей. В очаге проводят дезинфекцию, УФ-облучение.
Для специфической профилактики разработана химическая полисахаридная вакцина, состоящая из антигенов наиболее часто встречающихся менингококков (серогрупп А, С и др.). Иногда возможна пассивная специфическая профилактика у детей, контактировавших с больным ребенком, с помощью антименингококковых сывороток.
4. Методы получения чистой бактериальной культуры – бактериологический метод исследования. (74)
Это основной метод, используемый при лабораторной диагностике инфекционных заболеваний. Этапы: 1 этап (1 день) – посев исследуемого материала петлей, тампоном или шпателем на поверхность плотной пит.среды в чашку Петри так, чтобы получить изолиров-е колонии. В термостат
(37°С, 18-24ч).
2 этап (2 день): изуч-е культуральных (хар-р роста на пит.ср.), морфологических и тинкториальных св-в (мазок, окр. по Граму), подвижноти в препарате («раздавл.» капля), РА на стекле с диагностич. агглютинирующими сыв-ками. 3 этап (3 день): пересев на скош-й агар д/ выдел-я чистой культуры м/о.
Втермостат (37°С, 18-24ч).
1.Видовая идентификация выдел-й культуры на основании:
34
1)проверки чистоты культуры по морфологич. и тинкториальным св-вам (мазок и окр. по Граму)
2)опред-е б/х акт-ти (сахаро- и протеолитических, редуцирующих св-в)
3)опред-е каталазы
4)опред-е оксидазы
5)опред-е а/г св-в
6)патогенных св-в (плазмокоагулаза, лецитиназа, гиалуронидаза, гемолизин)
7)опред-е фаголизабельности
2. Посев на среды АГВ или Мюллера-Хинтона для опред-я чувствит-ти выдел-й культуры к химиотерапевтич. ср-вам. В термостат (37°С, 18-24ч) 4 этап (4 день):
1)устанавл-т принадлежн-ть выдел-й культуры к группе, сем-ву, роду, виду, сопоставляя св-ва культур с приведенными в определителе Берджи.
2)учитыв-т рез-ты резистограмм.
Культуральный метод исследования представляет собой выделение из питательной среды бактерий определённого вида путём культивирования, с их последующей видовой идентификацией. Вид бактерий определяется с учётом их строения, культуральных и экологических данных, а также генетических, биохимических и биологических показателей. После окончательной идентификации их характеристик, бактерии, выведенные из определённого места и в определённое время, получают название штамм.
Цель метода:
1.Выделение и идентификация чистой культуры бактерий.
2.Определение количества микроорганизмов и их особых характеристик. Например, специфическая реакция на антибиотики.
3.Выявление внутриродовых отличий микроорганизмов, на основе их эпидемиологической и генетической составляющей.
Выведение чистой культуры для аэробных и факультативных аэробных бактерий.
1этап. А) Подготовительные мероприятия. Эта стадия включает в себя забор, хранение и транспортировку материала. Обработка, в зависимости от свойств изучаемых бактерий. Например, при
35
обследовании материала на туберкулёз, для выявления кислоустойчивых микробактерий используются растворы щёлочи или кислоты.
Б) Обогащение. Данная стадия не является обязательной, если количества бактерий в исследуемом материале недостаточно. Например, при выделении гемокультуры, исследуемую кровь помещают в среду в соотношении 1 к 10 и хранят в течение суток при температуре 37.
В) Микроскопия. Мазок исследуемого материала окрашивается и изучается под микроскопом - исследуется микрофлора, её свойства и количество. В дальнейшем из первичного мазка необходимо отдельно выделить все находящиеся в нём микроорганизмы.
Г) Создание отдельных колоний. На чашку, со специальной, селективной средой, наносится материал, для этого используют петлю или шпатель. Далее, устанавливают чашку вверх дном, для защиты колоний от конденсата, и хранят в термостате около 20 часов, поддерживая температуру 37о .
2 этап. А) Изучение морфологических свойств колоний в средах и их микроскопия. Исследуются чашки и отмечаются свойства микроорганизмов, показатели их количества, темпы роста, а также отмечается наиболее подходящая питательная среда. Для изучения морфотипной чистоты культуры используют мазок колонии, его окрашивают (обычно используется метод по Граму или же любой другой) и тщательно микроскопируют.
Б) Накопление чистой культуры. Для этого колонии всех морфотипов рассаживают в отдельные пробирки с питательной средой и содержат в термостате при определённой температуре (для большинства микроорганизмов подходящей является температура 37о , но в некоторых случаях может быть иной). Питательной средой для накопления часто служит среда Клиглера.
Состав: · МПА · 0,1% глюкозы · 1% лактозы · Специальный реактив на сероводород · Феноловый красный индикатор.
3 этап. А) Уровень роста и чистоты культуры. Выведенная чистая культура имеет однородный рост и при микроскопическом рассмотрении клетки имеют одинаковое морфологическое и тинкториальное строение. Если в качестве питательной среды использовалась среда Клиглера, то по изменению цвета столбика и скошенной части определяются биохимические характеристики. Например, если происходит разложение лактозы - желтеет скошенная часть, если глюкозы - пожелтение столбика; при продукции сероводорода происходит почернение из-за перехода сульфата в сульфид железа.
В аэробной среде (скошенная поверхность) наблюдается более активное образование щёлочи, чем в анаэробной среде (столбик). Поэтому, когда происходит разложение глюкозы, кислота на скошенной поверхности без труда нейтрализуется.
Что касается анаэробной среды, то щелочных продуктов генерируется крайне мало, поэтому здесь можно наблюдать, как глюкоза ферментируется.
E. coli – способствует разложению глюкозы и лактозы с образованием газов, не производит сероводород. Вызывает пожелтение всей среды с разрывами.
S. paratyphi – способствует разложению глюкозы с образованием газов, лактозоотрицателен. Скошенная часть цвет не изменяет, столбик – желтеет.
S. paratyphi A- не продуцирует сероводород.
S. paratyphi B – сероводород продуцируется (по ходу укола проявляется чёрный цвет).
S. typhi – глюкоза разлагается без газообразования, сероводород продуцируется, лактозоотритателен. Скошенная часть не изменяет цвета, столбик – желтеет и среда чернеет по ходу укола.
Shigella spp.- лактозоотрицателен, глюкозоположителен, сероводород не продуцируется. Столбик приобретает жёлтый оттенок, а скошенная часть остаётся прежней.
Б) Финальная идентификация чистой культуры и её реакция на антибиотики. На данном этапе изучаются биохимические, биологические, серологические и генетические свойства культуры. В исследовательской практике не возникает необходимости в изучении полного спектра свойств микроорганизмов. Достаточно использовать простейшие тестирования для определения принадлежности микроорганизмов к тому или иному виду.
Билет 11
1. Сферопласты, протопласты, L-формы бактерий. Условия формирования и их медицинское значение. (12)
При воздействии на бактерию веществами, разрушающими пептидогликан, из грам (+) бактерий образуются протопласты (бактерии без КС), из грам (-) – сферопласты (с частичной КС).
Они в благоприятных условиях могут превращаться в исходную форму.
36
В неблагоприятных условиях (в том числе в изотонической среде из-за плазмолиза) они погибают либо теряют способность к размножению. Относительно стабильны в гипертонической среде.
Сферо- и протопласты, утратившие способность к синтезу пептидогликана и способные размножаться, называются L-формами (осмотически чувствительные, полиморфные клетки). Название получили, т.к. выделены в институте Листера. L-формы могут образовывать многие возбудители инфекционных болезней. Образуются в организме под действием антител, антибиотиков, АК, лизоцима, УФ- и рентгеновских лучей и длительно находиться в нем, формируя бактерионосительство.
Стабильные L-формы неспособны к реверсии (кроме частично утративших способность к синтезу пептидогликана), а отсутствие КС для них является защитным приспособлением (нет О-антигена). Имеют большое значение в развитии хронических рецидивирующих инфекций, бактерионосительстве, длительной персистенции их в организме. L-формы выявляются при фазовоконтрастной микроскопии.
2. Понятие о эубиозе, дисбиозе, дисбактериозе. Причины возникновения дисбиотических нарушений, последствия и методы коррекции (пробиотики, пребиотики, синбиотики). (52)
Эубиоз (эумикробиоз) - совокупность микробных популяций (микробиоценозов), населяющих естественные биотопы здорового человека. Глубокие количественные и (или) качественные изменения эубиоза обозначают термином дисбактериоз.
Дисбиоз - Нарушение равновесия микрофлоры, населяющей в норме нестерильные полости и кожные покровы человека.
Дисбактериоз - это синдром, возникающий при целом ряде заболеваний, который характеризуется изменением качественного и количественного состава нормофлоры. При дисбиотических нарушениях, происходят снижение колонизационной резистентности, угнетение функций иммунной системы, повышается восприимчивость к инфекционным заболеваниям.
Причины, приводящие к возникновению дисбактериозов:
•Длительная антибиотико-, химио или гормонотерапия. При использовании антибактериальных препаратов, относящихся к группе аминопенициллинов
•Воздействие жесткого γ-излучения (лучевая терапия, облучение).
•Заболевания желудочно-кишечного тракта инфекционной и неинфекционной этиологии (дизентерия, сальмонеллезы, онкологические заболевания).
•Стрессовые и экстремальные ситуации.
•Длительное пребывание в стационаре.
При бактериологическом исследовании регистрируется снижение количества или исчезновение одного или нескольких видов микроорганизмов - представителей индигенной микрофлоры, прежде всего бифидобактерий, лактобактерий. При этом увеличивается количество условно-патогенных микроорганизмов, которые относятся к факультативной микрофлоре.
Различают несколько стадий дисбактериоза.
•I стадия компенсированная - фаза латентная (субклиническая). Происходит уменьшение количества одного из представителей индигенной микрофлоры без изменения других составляющих биоценоза.
•II стадия - субкомпенсированная форма дисбактериоза. Происходят снижение количества представителей индигенной микрофлоры и увеличение условно-патогенной микрофлоры. Характерны дисфункция кишечника и местные воспалительные процессы, энтерит, стоматит. Для коррекции используютсяпре- и пробиотики.
•III стадия - декомпенсированная. Условно-патогенные микроорганизмы становятся доминирующими, и представители распространяются за пределы биотопа и появляются в полостях, органах и тканях, в которых они обычно не встречаются, напримерE. coli в желчных путях, Candida в моче. Назначению антибактериальных препаратов из группы фторхинолонов, монобактамов, аминогликозидов per os с последующей длительной коррекцией микрофлоры с помощью диетического питания, пре- и пробиотиков.
Существует несколько подходов в коррекции дисбиотических нарушений: - устранение причины;
- коррекция диеты (использование кисломолочных продуктов, продуктов питания растительного происхождения, диетических добавок, функционального питания); - восстановление нормальной микрофлоры - назначению про-, пре- и синбиотиков.
Пробиотики - живые микроорганизмы (молочнокислые бактерии, иногда дрожжи).
37
•Бифидосодержащие препараты. Их действующим началом являются живые бифидобактерии, Нормализуют микрофлору кишечника.
•Лактосодержащие препараты. Действующим началом этих препаратов являются живые лактобактерии, обладающие широким спектром антагонистической активности в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий, за счет продукции органических кислот, перекиси водорода, лизоцима.
Пребиотики - препараты немикробного происхождения, не способные адсорбироваться в верхних отделах пищеварительного тракта. Они способны стимулировать рост и метаболическую активность нормальной микрофлоры кишечника. Ими являются низкомолекулярными углеводами (олигосахариды, фруктоолигосахариды), содержащиеся в грудном молоке и в некоторых пищевых продуктах. Синбиотики - комбинация пробиотиков и пребиотиков.
3. Возбудитель сибирской язвы. Таксономия и биологическая характеристика. Эпидемиология и патогенез заболеваний. Микробиологическая диагностика. Специфическая профилактика и лечение. Особенность эпиднадзора сибирской язвы в Волгоградской области. (110)
Морфология. неподвижные грамположительные палочки. В мазках чистой культуры образуют длинные цепочки, напоминающие «бамбуковую трость». В организме или на среде с нативной сывороткой образуют капсулу. Культуральные свойства. B. anthracis — аэроб или факультативный анаэроб. Хорошо растет на простых питательных средах при 35–37 qС. Оптимум рН
7,2–7,6. На мясопептонном агаре образует серовато-белые колонии с отходящими от них волнистыми отростками, напоминающими «гриву льва» или «голову медузы».
Биохимические свойства. Ферментирует углеводы (глюкозу, фруктозу, декстран, крахмал, мальтозу) с образованием
кислоты без газа; разжижает желатину, казеин, фибриноген, фибрин, альбумин; выделяет Н2S. Антигенная структура. Имеет видоспецифический капсульный антиген,
представленный полипептидом D-глутаминовой кислоты. Родоспецифический соматический антиген представлен полисахаридами клеточной стенки. Это термостабильный антиген-гаптен,
используемый при постановке реакции термопреципитации по Асколи, неиммуногенен.
Протективный антиген, входящий в состав сибиреязвенного экзотоксина, отвечает за формирование в организме защитных антител.
Факторы патогенности. экзотоксин, содержит три фактора: летальный фактор, протективный антиген и фактор, вызывающий отек.
-Летальный фактор представлен цинкзависимой металлопротеазой, инактивирует протеинкиназы и избирательно поражает макрофаги.
-Протективный антиген координирует сборку отечного и летального факторов.
-Отечный фактор является кальмодулинзависимой аденилатциклазой, вызывающей повышение уровня АМФ в клетке-мишени и нарушение проницаемости клеточной стенки.
Споры сибирской язвы могут быть использованы в качестве биологического оружия.
Резистентность. чувствительны к 5%
раствору карболовой кислоты, 1% сулемы, 5% хлорной извести, формалину. при 60 qС в течение 15 мин, при кипячении через 1–2 мин.
Инактивация спор достигается автоклавированием при 160–170 qС и обработкой текучим паром (110 qС) в течение 5 мин.
Чувствительность к пенициллину используется в тесте «жемчужного ожерелья»: при выращивании с пенициллином возбудитель образует
сферопласты, виде «жемчужного ожерелья», выявляемого при микрокопии мазка.
Эпидемиология. Источник инфекции — больные животные (лошади, коровы, козы, ослы, овцы, олени, верблюды, свиньи и др.).
Резервуаром инфицированная почва. заразными считаются все аэрогенным,
38
фекально-оральным, контактным и редко кровяным механизмом через укусы членистоногих (слепней, мух, комаров).
Патогенез. Входными служит поврежденная кожа, реже слизистые оболочки дыхательных путей и ЖКТ. Споры поглощаются макрофагами, Продуцируя отечный и летальный факторы, они вызывают местные отеки, выпот и некротические
повреждения. В результате размножения в лимфатических узлах развивается региональный лимфаденит с последующим выходом возбудителя в кровь (бактериемия). Выработка экзотоксина в крови приводит к токсинемии с последующим шоком и гибелью инфицированного организма.
Иммунитет. развивается стойкий клеточно-гуморальный иммунитет.
Лечение. Наряду с антибиотикотерапией, применение противосибиреязвенного иммуноглобулина.
Профилактика. контроль за сырьем животного происхождения, особенно шкурами; сжигание трупов погибших животных и зараженных обеззараживание мест содержания больных животных; живую сибиреязвенную вакцину.
Микробиологическая диагностика.
Материал – экссудат из очага поражения (сибереязвенного карбункула), мокрота, фекалии, кровь, потенциально инфицированное сырье животного происхождения. От павшего животного берут ухо с той стороны, на которой лежал труп, туго перевязывают в двух местах и отрезают. Разрез между перевязками делают осторожно, чтобы кровь не попала на землю. Место разреза прижигают. Ухо, в перевязанном состоянии, заворачивают в пергаментную бумагу, смоченную 3% р-ром карболовой кислоты, упаковывают в металлический ящик, отправляют в лабораторию с нарочным. Бактериоскопический метод. Павших животных не вскрывают! Готовят мазки крови из перефирических вен уха. Мазки высушивают на воздухе, не фиксируют, тщательно упаковывают. Место надреза прижигают и смачивают креолином. Кровь берут только у свежего трупа. - окрашивают по Грамму; В препаратах - мазках – капсульные палочки; - МФА.
Бактериологический метод.
1 день Посев на плотные среды (КА, МПА). Посев крови на среды обогащения (МПБ) Инкубируют при
37С 18-20 часов.
2 день Изучение морфологии выросших колоний: На бульоне рост в виде хлопьевидного осадка, бульон остается прозрачным (R-форма). В S –форме – равномерное помутнение.
На агаре вирулентные штаммы образуют колонии в R- форме – крупные 3-5 мм, матовые, непрозрачные, шероховатые, с изрезанными краями. Авирулентные или слабовирулентные штаммы образуют S- форму - круглые гладкие колонии с ровными краями. На КА гемолиз отсутствует.
Бактериоскопия:
1.Под малым увеличение микроскопа колония имеет вид «головы медузы» или «львиной гривы» из-за цепочечного расположения палочек, которые образуют нити, отходящие от центра.
2.Готовят мазок, окрашивают по Грамму – видны крупные грамположительные палочки, расположенные цепочкой («бамбуковая трость»). Спора располагается центрально, не деформирует клетку. Имеется капсула.
3.МФА. Получение чистой культуры для изучения биохимических свойств: посев на скошенный МПА. Инкубируют при 37С 18-20 часов.
3день Изучение биохимических свойств: - посев на среды «пестрого ряда» - ферментирует сахара с образованием кислоты без газа; - биостаза (+); - медленно разжижает желатин (елочка верхушкой вниз); - цитохромоксидаза (+); - каталаза (+); - пероксидаза (+); уреазная, лицитиназная, фосфатазная активность (-) (NB !) - гемолитическая активность (-); - образует Н2S; - феномен «жемчужного ожерелья».
На агаре содержащем 0,05-0,5 ЕД/мл пенициллина через 3 часа роста бациллы переходят в Lформу: образуются шаровидные формы, располагающиеся цепочкой - феномен « жемчужного ожерелья»; - чувствительность к бактериофагу (+) Инкубируют при 37С 18-20 часов.
4день Учет биохимических свойств, чувствительности к антибиотикам. Выдача результата.
Биологический метод.
Материал вводят подкожно белым мышам у корня хвоста 0,1 мл, морским свинкам в область спины 0,2 мл. Гибель через 36-48-72 часов; Бактериоскопия. Павших животных вскрывают, готовят мазки из паренхиматозных органов и крови. - окрашивают по Грамму; В препаратах - мазках – капсульные
39
палочки; - МФА. После 5-18 ч после заражения палочки можно обнаружить в экссудате. Делают посевы для выделения чистой культуры.
Аллергический метод.
Внутрикожно вводят 0,1 мл антраксина на внутреннюю поверхность предплечья. Антраксин - белковополисахариднонуклеиновый комплекс, извлекаемый при гидролизе из бацилл. При положительной реакции через 24 часа появляются гиперемия и инфильтрат. Положительная проба выявляет сенсибилизацию у больных (со 2-ой нед. заболевания), переболевших и привитых 59 (РГЗТ). Проявляется в первые дни болезни или после вакцинации и сохраняется несколько (30) лет.
Серологический метод.
1.ИФА, РНГА - исследуемый материал и выделенная культура исследуется на наличие «протективного антигена» и токсинов; 2.Реакция термопреципитации Асколи.. Обнаруживают термостабильный О-Аг. Из материала
(животное сырье, трупы) извлекают гаптен ( простерилизованный в автоклаве материал измельчают, экстрагируют 16-20 часов при 8-14 ºС в физ. растворере и фильтруют). Экстракт наслаивают на сибиреязвенную сыворотку. Преципитирущую сибереязвенную сыворотку получают путем гипериммунизации лошадей убитой культурой B. anthrasic. В «+» случае в течении 15 сек, но не позже 2 мин образуется кольцо преципитации на границе 2-х сред.
3.Для выявления антител: латекс-агглютинация и пассивная агглютинация с протективным сибиреязвенным антигеном.
ПЦР – диагностика. Обнаруживают ДНК возбудителя: - в исследуемом образце материала; - в выделенной чистой культуре.
4. Методы культивирования облигатных анаэробов. (91)
Условия культивирования:
Анаэробы –пониж. содер. кислорода, облигатные- при его отсутствии (посев материала внутрь жидкой или полутверд.среды)
Первый день. Материал (прогр. на кипящей водяной бане в теч. 10-20 мин) засевают в пробирку со ср. Китта-Тароцци=> охладить до 30-37 С. При выделении споровых форм анаэробов засеянную среду вновь прогревают на водяной бане при 80 С в теч. 20 мин для уничтожения неспоровых форм бактерий, затем инкубируют в терм. при 37 С.
Второй день. Просматривают посевы, приготавливают мазки и окрашивают по Граму. В положит. случае обнаруж. помутнение и пузырьки газа в среде и крупные споровые грамполож. палочки.
Для выделения чистой культуры по методу Цейслера петлю материала из среды Китта-Тароцци наносят на кровяной сахарный агар в первую чашку Петри и распределяют шпателем по поверхности среды, затем этим же шпателем втирают материал в среду второй и третьей чашек для получения изолир. колоний.
По методу Вейтберга одну или две петли материала из среды Китта-Тароцци вносят в пробирку с бульоном для разведения материала. Затем пастеровской пипеткой с запаянным концом переносят материал последовательно в 3-5 узких пробирок с предварительно прокипяченным остуженным до 50 С сахарным мясо-пентонным агаром, погружая капилляр пипетки в расплавленный агар до самого дна пробирки.
Засеянные пробирки быстро охлаждают под струей воды, при этом агар застывает и фиксирует разобщенное положение отдельных микробных клеток в глубине столбика агара.
Третий день. Выросшие на чашках или в глубине агара в узких пробирках колонии изучают с помощью лупы. На месте отобранной для выделения чистой культуры колонии делают распил пробирки, колонию отсасывают пастеровской пипеткой и переносят в пробирку со средой Китта-Тароцци, которую помещают в термостат.
Питательные среды и культивирование на них анаэробов.
1.Жидкие питательные среды. А)Мясо пептонный печеночный бульон – Среда Китт-Тороццы-
является основной жидкой питательной средой Для его приготовления используется 1000 г. бычьей печени, которую заливают 1.л водопроводной воды и стерилизуют 40 мин. При t=110 С - разводят 3-х кратным количеством МПБ - устанавливают рн=7,8-8,2 - + на 1 л. бульона 1,25 г. Nacle - добавляют маленькие кусочки печени - на поверхность среды наслаивают вазелиновое масло - автоклавируют t=10112 C – 30-45 мин.
40