2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Микробиология от Насти

3) стадия вторичных заболеваний, проявляющихся поражением дыхательной, нервной системы. Завешается ВИЧ-инфекция последней, 4-й терминальной стадиейСПИДом. Микробиологическая диагностика. Вирусологические и серологические исследования включают методы определения антигенов и антител ВИЧ. Для этого используют ИФА, ИБ и ПЦР. Сыворотки больных ВИЧ-1 и ВИЧ-2 содержат антитела ко всем вирусным белкам. Однако для

подтверждения диагноза определяют антитела к белкам gp41, gpl20, gpl60, p24 у ВИЧ-1 и антитела к белкам gp36, gpl05, gpl40 у ВИЧ-2.

ВИЧантитела появляются через 2—4 недели после инфицирования и определяются на всех стадиях ВИЧ.

Метод выявления вируса в крови, лимфоцитах. Применяют также ПЦР.

Диагностическая иммуноферментная тест-система для определения антител к ВИЧ – включает вирусный АГ, адсорбированный на носителе, АТ против Ig человека. Используется для серодиагностики СПИДа.

Лечение: применение ингибиторов обратной транскриптазы, действующих в активированных клетках. Препараты являются производные тимидина — азидотимидин и фосфазид.

4. Методы микроскопии. (73)

Билет 1

Билет 37 1. Клиническая и санитарная микробиология. Роль и задачи в борьбе с инфекционной патологией, объекты исследования. (39)

Санитарная микробиология изучает микрофлору окружающей среды и влияние микрофлоры на здоровье человека и экологическую ситуацию в различных биотопах.

Главная задача практической санитарной микробиологии – раннее обнаружение патогенной микрофлоры во внешней среде.

Санитарно-показательные микроорганизмы (СПМ) – это представители нормальной микрофлоры,

которые выделяются естественным путем в окружающую среду и там сохраняются, поэтому служат показателями санитарного неблагополучия, потенциальной опасности исследуемых объектов.

СПМ условно разделяют на 3 группы:

1.Группа А включает обитателей кишечника человека и животных, эти микроорганизмы расценивают как индикаторы фекального загрязнения.

В нее входят бактерии группы кишечной палочки (БГКП) – эшерихии, энтерококки, протеи, сульфитвосстанавливающие клостридии (С. perfringens), термофилы, бактериофаги, ацинетобактер, аэромонады.

2.Группа В включает обитателей верхних дыхательных путей и носоглотки. В нее входят a- и b-

гемолитические стрептококки, стафилококки (плазмокоагулирующие, лецитиназоположительные, гемолитические и антибиотикоустойчивые).

3.Группа С включает сапрофитические микроорганизмы, обитающие во внешней среде, их расценивают как индикаторы процессов самоочищения. В нее входят бактерии-аммонификаторы, бактерии-нитрификаторы, некоторые спорообразующие бактерии, грибы, актиномицеты, целлюлозобактерии, сине-зеленые водоросли.

Санитарная микробиология изучает микрофлору воды, воздуха, почвы, пищевых продуктов и других объектов, определяя их санитарно-эпидемиологическое благополучие.

Важнейшими задачами санитарной микробиологии:

определение наличия болезнетворных микробов и ядовитых продуктов их жизнедеятельности в изучаемых объектах,

выявление и оценка степени недоброкачественности продуктов, особенно пищевых, изменения которых вызываются микробами.

разработкой рекомендаций по оздоровлению окружающей среды путем воздействия на ее микрофлору и оценкой степени эффективности мероприятий, проводимых в это направлении.

обнаружение в исследуемых объектах патогенных микробов и их токсинов.

Клиническая микробиология – раздел частной медицинской микробиологии, в котором изучаются представители нормальной микрофлоры организма человека и условно-патогенные микроорганизмы, не имеющие существенного эпидемиологического значения, но в определенных условиях служащие причиной заболеваний.

131

Цель клинической микробиологии – клинико-лабораторная диагностика, специфическая профилактика и химиотерапия инфекционных болезней, часто встречающихся в широкой медицинской практике в неинфекционных клиниках.

Задачи клинической микробиологии:

1.Изучение роли условно-патогенных микроорганизмов в патогенезе инфекционных заболеваний;

2.Разработка методов лабораторной диагностики, специфической профилактики и этиотропной терапии инфекционных заболеваний в неинфекционных лечебных учреждениях;

3.Исследование эпидемиологии внутрибольничных инфекций;

4.Мониторинг лекарственной устойчивости возбудителей в ЛПУ.

Признаки, отличающие клиническую микробиологию от инфекционной:

Углубленное изучение структуры и важнейших биологических свойств условно-патогенных микроорганизмов;

Выявление причин появления факторов вирулентности у представителей нормальной микрофлоры организма человека;

Анализ взаимоотношений условно-патогенных микроорганизмов с организмом человека при определенных условиях природной и социальной среды.

2. Иммунитет. Определение и задачи иммунитета, понятие о врожденном и приобретенном иммунитете. Типы приобретенного иммунитета. (58)

Билет 19, 22

3. ВИЧ-инфекция. Таксономия и биологическая характеристика. Эпидемиология и патогенез заболевания. Лабораторная диагностика. Специфическая профилактика и лечение на современном этапе. Особенность циркуляции ВИЧ - инфекции в Волгоградской области. (147)

Билет 36

4. Реакция агглютинации. Компоненты, цель и методы постановки, учет. (79)

Билет 3, 26

Билет 38 1. Влияние физических и химических факторов на микроорганизмы. Понятие о

дезинфекции, стерилизации, асептике и антисептики. Методы обработки и способы контроля. (25)

Билет 26

2. Понятие об экосистеме и ее составляющих (биоценоз, биотоп, обмен энергией). Формы биотических взаимоотношений (симбиоза). (37)

Экология изучает взаимоотношения микроорганизмов между собой и внешней средой, которые обусловливают их размножение, развитие и выживание.

Под экологической системой понимают совместное функционирование различных биоценозов, т.е. биотического сообщества, включающего все популяции, занимающие данную изучаемую площадь и неживую окружающую природу – биотоп.

Задачи экологии, которые решает медицинская микробиология:

1.изучение закономерностей воздействия различных факторов окружающей среды на человека, на его нормальную микрофлору.

2.Разработка методов индикации микробного загрязнения окружающей среды.

3.Определение распространения в окружающей среде микробов-продуцентов биологически активных веществ (и продуктов их жизнедеятельности – токсинов) и оценка их роли в патологии человека.

4.Изучение процессов самоочищения окружающей среды.

5.Дальнейшее совершенствование методов борьбы с внутрибольничной инфекцией.

Биоценоз – микробное сообщество, ассоциация – совокупность популяций разных видов микроорганизмов, обитающих в определенном биотопе (например, в полости рта, в кишечнике, водоеме).

Биотоп – место обитания популяции.

Эковар – это вариант какого-либо микроорганизма, приспособленного жить в определенной экосистеме.

Экологические связи в микробиоценозах.

132

Симбиоз включает следующие основные формы взаимоотношений: нейтрализм – вид отношений, когда обитающие популяции не оказывают друг на друга ни стимулирующего, ни подавляющего действия; комменсализм – вид сожительства, при котором один из симбионтов живет за счет другого и не причиняет ему вреда. К комменсалам относят представителей нормальной микрофлоры организма человека. Они питаются остатками пищи хозяина, которые в его рационе не имеют значения.

Мутуализм – взаимовыгодное сожительство – клубеньковые бактерии обладают способностью фиксировать свободный азот воздуха и создают азотистые соединения, необходимые для бобовых растений.

Сателлизм – стимуляция размножения микроба другим, сопутствующим видом: сарцины, дрожжи выделяют факторы роста, необходимые для коклюшной палочки.

Синергизм – усиление физиологических функций и свойств бактерий при их совместном культивировании.

Паразитизм – один вид живет за счет другого и наносит ему вред (типичным примером являются паразиты бактерий – бактериофаги).

Антагонистические или конкурентные взаимоотношения лежат в основе инфекции, инвазии,

антибиотикотерапии. Антагонизм бывает явный, когда антагонист выделяет антибиотические вещества постоянно, независимо от того, есть конкурент или нет; вынужденный – антибиотические вещества выделяются только в присутствии конкурента; насильственный – когда микробы не являются антагонистами, но при культивировании на голодных средах микроб с большей ферментативной активностью использует другой как продукт своего питания.

Механизмы антагонизма:

истощение питательной среды;

изменение рН, осмотического давления, дефицит кислорода;

образование антибиотических веществ, губительно действующих на микробовконкурентов.

3.Вирус кори. Таксономия и биологическая характеристика. Эпидемиология и патогенез заболевания. Лабораторная диагностика. Специфическая профилактика и лечение на современном этапе. (144)

Корь — острая инфекционная болезнь, характеризующаяся лихорадкой, катаральным воспалением слизистых оболочек верхних дыхательных путей и глаз, а также пятнисто-папулезной сыпью на коже.

Таксономия. РНК-содержащий вирус. Семейства Paramyxoviridae. Род Morbillivirus.

Структура и антигенные свойства. Вирион окружён оболочкой с гликопротеиновыми шипами. спиральный нуклеокапсид. Геном вируса — однонитевая, нефрагментированная минус РНК. Имеются белки: NP — нуклеокапсидный; М — матриксный, белки липопротеиновой оболочки — гемагглютинин (Н) и белок слияния (F), гемолизин.

Вирус обладает гемагглютинирующей и гемолитической активностью. Нейраминидаза отсутствует. Культивирование. Культивируют на первично-трипсинизированных культурах клеток почек обезьян и человека, перевиваемых культурах клеток HeLa, Vero.

Возбудитель размножается с образованием— симпластов; появляются цитоплазматические и внутриядерные включения.

Белок F вызывает слияние клеток.

Резистентность. при комнатной температуре инактивируется через 3-4 ч. Быстро гибнет от солнечного света, УФ-лучей. Чувствителен к детергентам, дезинфектантам. Восприимчивость животных.

Корь воспроизводится только на обезьянах, остальные животные маловосприимчивы. Эпидемиология. Корь — антропонозная инфекция, распространена повсеместно. Болеют люди разного возраста, но чаще дети 4—5 лет. Источник инфекции — больной человек.

Основной путь инфицирования— воздушно-капельный, реже — контактный.

Патогенез. Возбудитель проникает через слизистые оболочки верхних дыхательных путей и глаз, откуда попадает в подслизистую оболочку, лимфатические узлы. После репродукции он поступает в кровь (вирусемия) и поражает эндотелий кровеносных капилляров, обуславливая тем самым появление сыпи. Развиваются отек и некротические изменения тканей.

Клиника. Инкубационный период 8-15 дней. Вначале отмечаются острые респираторные проявления (ринит, фарингит, конъюнктивит, фотофобия, температура тела 39С). З атем, на 3—4-й день, на слизистых оболочках и коже появляется пятнисто-папулезная сыпь. За сутки до

появления сыпи на слизистой оболочке щек появляются мелкие пятна, окруженные красным ореолом.

133

Заболевание длится 7—9 дней. Возбудитель вызывает аллергию, подавляет активность Т-лимфоцитов и иммунные реакции. Редко развиваются энцефалит и ПСПЭ.

Иммунитет. стойкий пожизненный иммунитет.

Микробиологическая диагностика. Исследуют смыв с носоглотки, соскобы с элементов сыпи, кровь, мочу.

Вирус кори можно обнаружить в патологическом материале и в зараженных культурах клеток с помощью РИФ, РТГА и реакции нейтрализации.

Для серологической диагностики применяют РСК, РТГА и реакцию нейтрализации.

Лечение. Симптоматическое. Специфическая профилактика. введением детям первого года жизни или живой коревой вакцины (против кори, паротита, краснухи). В очагах кори ослабленным детям вводят нормальный иммуноглобулин человека.

4. Аллергологический метод исследования. Клинико-диагностическое значение гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). Постановка и оценка аллергической пробы на примере реакции Манту. (77)

Билет 13

Билет 40 1. Понятие об инфекции, инфекционном процессе, инфекционном заболевании. Участники инфекционного процесса. (40)

Билет 7

2. Врожденный иммунитет. Уровень реакции на чужеродность. Тканевые, гуморальные и функциональные факторы неспецифической защиты. Фагоцитоз. (59)

Билет 18

3. Пищевые токсикоинфекции. Этиология, эпидемиологическая и клиническая характеристики, патогенез, лабораторная диагностика, лечение и профилактика. (134)

Пищевые токсикоинфекции - острые кишечные инфекции, вызванные употреблением в пищу продуктов, содержащих микроорганизмы и их токсины.

Пищевые токсикоинфекции характеризуются внезапным началом, приступами тошноты и многократной рвоты, диареей, схваткообразными болями в животе, повышением температуры и симптомами интоксикации.

Диагностика - бактериологического исследования рвотных масс, промывных вод желудка, испражнений, пищевых продуктов.

Пищевые токсикоинфекции (пищевой бактериотоксикоз) – это группа острых инфекционных заболеваний, возникающих в результате отравления человека пищевыми продуктами, содержащими производимые условно-патогенной флорой экзотоксины.

Опасность пищевых токсикоинфекций обусловлена частотой возникновения массовых вспышек, сложностью обнаружения источника инфекции, возможностью развития инфекционнотоксического, дегидратационного шока и даже летального исхода, особенно среди детей и лиц пожилого возраста.

Причины Возбудителем пищевой инфекции могут быть микроорганизмы различных родов: Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Enterococcus и др. Источником и резервуаром инфекции, обычно, являются люди и сельскохозяйственные животные, птица.

Чаще всего это лица, страдающие заболеваниями бактериальной природы с активным выделением возбудителя (гнойные заболевания, ангины, фурункулез), молочный скот, больной маститом. Для некоторых резервуаром может служить почва и вода, загрязненные фекалиями животных и человека объекты окружающей среды.

Токсикоинфекции передаются по фекально-оральному механизму преимущественно пищевым путем. При употреблении: мяса, молочных продуктов, кондитерских изделий с жирными кремами, рыбы.

В передаче инфекции могут принимать объекты и предметы, источники воды, почва, пыль.

Для заболевания характерна сезонность: в теплое время года частота токсикоинфекций увеличивается. Лица с ослабленными защитными свойствами организма входят в группу особого риска, токсикоинфекции у них могут протекать наиболее тяжело.

В патогенезе токсикоинфекций основную роль играют токсины. Инкубационный период несколько часов. Заболевание обычно начинается остро, с приступов тошноты и многократной рвоты, энтеритной диареи.

134

Частота дефекаций достигает 10 раз в сутки и более. Могут наблюдаться боли в животе, признаки интоксикации. Быстрая потеря жидкости с рвотой и калом приводит к развитию синдрома дегидратации.

Для стафилококковой инфекции характерны: резкие боли в области желудка; многократная рвота; выраженное снижение артериального давления; в первые часы заболевания возможны судороги; часто заболевание протекает без диареи (поноса).

Инфекция, вызванная клостридиями (Clostridium perfringens) характерными признаками являются: диарея с примесью крови; температура остается нормальной. При попадании возбудителя в кровоток возможно повреждение целостности сосудов и развитие кровоизлияний в легких, почках, селезенке.

При токсикоинфекциях, вызванных вульгарным протеем (Proteus vulgaris), отмечается наличие жидкого зловонного стула.

Для заболеваний, вызванных клебсиеллой, характерно: повышение температуры тела

(продолжительностью до 3-х суток); нестерпимая боль в животе; громкое урчание; зловонные испражнения.

Диагностика. Производят выделение возбудителя из рвотных масс, испражнений, промывных вод желудка. Посев на питательные среды и определяют его токсигенные свойства. Серологические тесты. Лечение. зондирование и промывание желудка (в первые же часы возникновения клинических признаков отравления). Для освобождения от токсинов кишечника применяют энтеросорбенты и производят сифонную клизму.

Для предупреждения дегидратации больному дают дробно небольшими порциями регидратационные растворы, сладкий чай. При развитии тяжелой степени дегидратации производят внутривенное введение регидратационных смесей. При тяжелом течении могут назначаться антибактериальные средства.

Профилактика. заключается в мерах санитарно-гигиенического контроля на предприятиях и хозяйствах, осуществляется ветеринарный контроль над состоянием здоровья сельскохозяйственных животных.

Индивидуальная профилактика заключается в соблюдении правил личной гигиены, хранения и кулинарной обработки пищевых продуктов.

4. Реакция преципитации. Механизм, компоненты, способы постановки, области применение. (81)

Билет 6, 28

Билет 5 1. Характеристика основных морфологических форм бактерий. Строение бактериальной клетки. (6)

Морфологию бактерий изучают с использованием различных микроскопов при просмотре неокрашенных и окрашенных препаратов (мазков).

По форме бактерии делятся на кокки (шаровидные), палочковидные (цилиндрические) и извитые

(спиралевидные).

1.Кокки - шаровидные микроорганизмы сферической, элипсовидной, ланцетовидной или бобовидной формы. В зависимости от размера бактерий и характера разделяют на:

-микрококки – характеризуются одиночным и беспорядочным расположением клеток; -диплококки - группа кокков, которые после деления не расходятся, а существуют парами.

Типичными представителями являются возбудители, пневмонии и гонореи; -стрептококки - микробы, которые формируют цепочки, которые состоят из 3-4, круглой или

элипсовидной формы. Часть из них являются непатогенными представителями нормальной микрофлоры человека, другие вызывают тяжелые гнойно-септические процессы (пневмонию, менингит, остеомиелит, холецистит, сепсис и др.).; -стафилококки - кокки, которые в виде виноградной грозди. Стафилококки широко

распространены в воздухе, почве, организме человека и животных. Многие их представители вызывают многообразные гнойно-септические заболевания: фурункул, карбункул, гидроаденит, флегмону, нефрит, холецистит, менингит, пневмонию, сепсис и др.; -тетракокки - кокки, которые образуют тетрады; -сарцины - кокки, располагаются в виде пакетов из 8, 16, 32, 64 клеток.

2.Палочковидные или цилиндрические – самые распространенные бактерии. Они могут быть разнообразной формы (цилиндрической, эллипсовидной, овальной, веретенообразной, в виде

135

барабанной палочки или теннисной ракетки. Их концы могут быть ровные, округлые, заостренными или обрубленные и даже вогнутые.

Палочковидные бактерии, разделяют на собственно бактерии, бациллы и клостридии.

1.Собственно бактерии - микроорганизмы, которые не способны образовать споры.

2.Бациллы и клостридии способны образовывать споры.

Убацилл очень крупные клетки и размер спор не превышает диаметр клетки.

Уклостридий обычно тонкие и длинные клетки, а споры существенно превышают их диаметр, придавая клеткам форму ракетки.

От способа расположения в мазках, палочковидные микрооганизмы разделяют на монобактерии, монобацилы, диплобактерии, диплобацилы, стрептобактерии, стрептобацилы.

3. Извитые (спиралевидные) бактерии имеют извитую, штопорообразную форму. К этой группе бактерий принадлежат вибрионы, спириллы, спирохеты.

1.Вибрионы- бактерии, с одним небольшим изгибом размером 1/4 завитка спирали, что предоставляет им сходство с запятой.

2.Спириллы - бактерии, которые имеют несколько изгибов, поэтому они напоминают штопор.

3.Спирохеты также имеют штопороподобную форму и различаются между собой числом завитков и длиной

2. Общая характеристика условно-патогенных микроорганизмов. Причины развития инфекционного процесса. (46)

Условнопатогенными называют микроорганизмы, способные вызывать заболевания в определенных условиях: накопление в больших количествах и снижение защитных сил животного организма. Условнопатогенными являются представители постоянной микрофлоры человека и животных, а также некоторые микроорганизмы внешней среды.

Относят золотистый стафилококк, гемолитический стрептококк, синегнойную палочку, клибсиеллу, энтеробактерии.

Выделяют токсины двух видов: экзотоксины и эндотоксины.

Условия, способствующие реализации патогенного потенциала условнопатогенными бактериями:

• Снижение уровня иммунной защиты • Смена биотопа • Увеличение количества (концентрации) микроорганизмов в биотопе

3. Возбудители холеры. Таксономия и биологическая характеристика. Эпидемиология и патогенез заболеваний. Микробиологический диагноз. Лечение. Особенность эпиднадзора холеры в Волгоградской области. (104)

Возбудитель – Vibrio cholerae, характеризуется токсическим поражением тонкого кишечника, нарушением водно-солевого баланса.

Морфологические и культуральные свойства. Вибрион имеет один жгутик. Под действием пенициллина образуются L-формы.

Грамотрицательны, спор не образуют. Факультативный анаэроб.

Не требователен к питательным средам. Температурный оптимум 37C. На плотных средах вибрионы образуют мелкие круглые прозрачные Sколонии с ровными краями. На скошенном агаре образуется желтоватый налет. В непрозрачных Rколониях бактерии становятся устойчивыми к действию бактериофагов, антибиотиков и не агглютинируются О-сыворотками.

Биохимические свойства. Активны: сбраживают до кислоты глюкозу, мальтозу, сахарозу, маннит, лактозу, крахмал. Первую группу, к которой относятся истинные возбудители холеры, составляют вибрионы, разлагающие маннозу и сахарозу и не разлагающие арабинозу: разлагают белки до аммиака и индола. H2S не образуют.

Антигенная структура. Термостабильный О-антиген и термолабильный Н-антиген. Н-АГ являются общими для большой группы вибрионов.

Возбудители классической холеры и холеры Эль-Тор объединяются в серогруппу 01. Антигены серогруппы 01 включают в различных сочетаниях А-, В- и С-субъединицы.

Сочетание субъединиц АВ называется сероваром Огава, сочетание АС — сероваром Инаба, сочетание ABC — Гикошима. Rформы колоний утрачивают О-АГ.

Резистентность. Вибрионы плохо переносят высушивание. Долго сохраняются в водоемах, пищевых продуктах.. Биовар Эль-Тор более устойчив в окружающей среде, чем классический вибрион.

136

Эпидемиология. Острая кишечная инфекция с фекально-оральным механизмом передачи. Путь передачи - водный, пищевой. Источник инфекции — больной человек или вибрионоситель. Факторы патогенности. Пили адгезии; фермент муциназа, разжижающий слизь и обеспечивающий доступ к эпителию.

Эпителиальные клетки выделяют щелочной секрет, который в сочетании с желчью является прекрасной питательной средой для размножения вибрионов. Токсинообразование вибрионов, которые вырабатывают эндо- и экзотоксины.

Экзотоксин (энтеротоксин) холероген — термолабильный белок, чувствителен к протеолитическим ферментам.

Холероген содержит 2 субъединицы: А и В. А активизирует внутриклеточную аденилатциклазу, происходит повышение выхода жидкости в просвет кишечника. Диарея, рвота.

Фермент нейраминидаза усиливает связывание холерного экзотоксина с эпителием слизистой кишечника.

Эндотоксин запускает каскад арахидоновой кислоты, которая запускает синтез простагландинов (Е, F). Они вызывают сокращение гладкой мускулатуры тонкого кишечника и подавляют иммунный ответ, чем обусловлены диарея.

Клинические проявления. Инкубационный период 2—3 дня. Боль в животе, рвота, диарея. Иммунитет. Гуморально-клеточный. При выздоровлении возникает напряженный непродолжительный иммунитет.

Микробиологическая диагностика. Выделение и идентификация возбудителя. Материал для исследования - выделения от больных (кал, рвота), вода.

Для экспресс-диагностики используют РИФ, ПЦР. Бактериоскопический метод в настоящее время не используется.

Лечение: а) регидратация (восполнение потерь жидкости и электролитов введением изотонических, растворов, а также плазмозаменяющих жидкостей внутривенно; б) антибактериальная терапия (тетрациклины, фторхинолоны).

Профилактика. Санит.-гиг. мероприятия. Экстренная профилактика антибиотиками широкого спектра действия, а также вакцинопрофилактика. Современная вакцина представляет собой комплексный препарат, состоящий из холероген-анатоксина и химического О-антигена, обоих биоваров и сероваров Огава и Инаба. Прививка обеспечивает выработку вибриоцидных антител и антитоксинов в высоких титрах.

4. Полимеразная цепная реакция. Определение, теоретические и практические основы. (75)

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - экспериментальный метод, который представляет собой специфическую амплификацию нуклеиновых кислот, индуцируемую синтетическими олигонуклеотидными праймерами in vitro.

Исходные компоненты полимерзаной цепной реакции ДНК-матрица (анализируемый объект) - ДНК или ее часть, содержащая искомый специфический фрагмент.

Праймеры- синтетические олигонуклеотиды, комплементарные последовательностям ДНК на ее границах определяемого специфического фрагмента.

Смесь дезоксинуклеотидприфосфатов (дНТФ)- смесь четырех видов нуклеотидов: дезоксиаденозинтрифорсфат (дАТФ), дезоксигуанозинтрифосфат (дГТФ), дезоксицитидинтрифосфат (дЦТФ), дезокситимидинтрифосфат (дТТФ); являются материалом для синтеза новых комплементарных цепей ДНК.

Фрагмент Taq-полимераза – термостабильная ДНКполимераза, катализируюшая удлинение цепец праймеров путем последовательного присоединения нуклеотидных оснований к растущей цеписинтезируемой ДНК.

Буферный раствор – реакционная среда, содержащая ионы Mg2+ , необходимые для поддержания активности фрагмента Taq-полимеразы.

Положительный контроль – образец ДНК выделяемой биологической системы.

Весь технологический процесс исследования с использованием ПЦР включает:

1)подготовка образца – выделение ДНК из пробы и ее очистка

2)проведение самой ПЦР, направленной на умножение фрагментов ДНК возбудителя заболевания

3)детекция амплифицированных фрагментов и оценка результатов.

137

Для проведения ПЦР используется специальное устройство – термоциклер (амплификатор), представляющий собой аппарат, в гнезда котрого устанавливается специальные пробирки, изготовленные из особого термопроводимого пластика, с реакционной смесью.

Каждый цикл ПЦР включает три этапа:

1 этап. Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали ДНК на две отдельные цепи). Протекате при температуре 93-95 градусов в течение 30-40 секунд.

2 этап. Присоединение праймеров (отжиг). Присоединение праймеров происходит комплементарно к соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфического участка.

Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значения которой располагается в интервале 50-65 градусов. Время отжига – 20-60 секунд.

3 этап. Элонгация (достраивание цепей ДНК). Процесс катализируется ферментов темостабильной ДНК-полимеразой (Taq-полимеразой), которая прикрепляется к 3 концупраймера; происходит комплементарное достраивание цепей ДНК в противоположных направлениях, начиная с участков присоединение праймеров.

Материалом для синтеза новых цепей ДНК служит добавляемые в раствор дНТФ. Протекает при температуре 72 градуса в течение 2040 секунд.

Образовавшиеся в первом цикле амплификации две новые цепи ДНК служат матрицами для второго цикла амплификации. Для получения достаточного количества копий искомогофрагмента ДНК амплификация включает 20-40 циклов.

Детекцию продуктов амплификации, т.е выявление амплифицированных фрагментов проводят с помощью электрофореза в агарозном геле или гибридизационноферментативным методом, с последующей оценкой

Интерпретация результатов ПЦР:

Ложноположительные результаты могут наблюдаться в результате контаминации продуктами амплификации (ампликонами), поскольку в процессе работы ампликоны накапливаются в больших количествах и переносятся с аэрозолями и через приборы. Следовательно, для исключения перекрестного загрязнения исследуемых проб выделение нуклеиновых кислот должно проводиться с соблюдением ряда условий (например, разделение ПЦР-лаборатории на зоны, использование перчаток, одноразовых пробирок и т.д.)

Ложноотрицательные результаты могут наблюдаться в результате снижения чувствительности ПЦР при ингибировании реакции компонентами биологических образцов.

138

ОСТАВШИЕСЯ ПРЕДПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ:

11. Схема строения жгутика бактерий.

Жгутики обеспечивают подвижность клеток в жидкой или на поверхности твёрдых сред.

Состоят из: Сам жгутик (филамент, фибрилла) –

спирально изогнутая полая нить, состоящая из белка флагеллина.

Крюк – более толстый, чем сам жгутик изогнутое образования, состоящий из белка (но не флагеллина).

Базальное тело (трансмембранный мотора). Базальное тело представляет собой стержень (ротор) с одной или двумя парами дисков (MSкольцами). Вокруг кольца расположены белковые

комплексы (протонные каналы) выполняющие роль статора в этом моторчике.

Поступление протонов из внешней среды приводят к повороту MS-кольца и далее, соответственно стержня, крюка и самого жгутика.

У грамотрицательных бактерий две пары колец: внешняя (кольца L и Р) и внутренняя (кольца S и М). Жгутики грамположительных бактерий, имеющих более толстую гомогенную клеточную стенку, содержат только одну пару колец – S и М.

Число жгутиков и их расположение варьирует: монотрихи, лофотрихи, амфитрихи, перитрихи.

Лофотрихи имеют пучок жгутиков на одном конце клетки.

Амфитрихи имеют по одному жгутику или пучку жгутиков на противоположных концах клетки. Расположение жгутиков у бактерий.

Жгутики выявляют при помощи электронной микроскопии препаратов, напыленных тяжелыми металлами, или в световом микроскопе после обработки специальными методами, основанными на протравливании и адсорбции различных веществ, приводящих к увеличению толщины жгутиков (например, после серебрения).

Подвижность бактерий определяют при помощи фазово-контрастной или световой микроскопии«раздавленной» или «висячей» капли).

36. Понятие о рекомбинации. Механизмы передачи генетического материала у бактерий и их значение в инфекционной патологии.

Рекомбинации – это обмен генетическим материалом (отдельными фрагментами двойных спиралей ДНК) между двумя особями с появлением рекомбинантных особей с измененным генотипом. Генетическая рекомбинация - главный фактор непостоянства генома, основа большинства его изменений, обусловливающая естественный отбор, микро- и макроэволюции.

У бактерий существует несколько механизмов рекомбинации:

1) конъюгация; 2) трансформация; 3) трансдукция.

Трансформация – передача генетической информации в виде изолированных фрагментов ДНК при нахождении реципиентной клетки в среде, содержащей ДНКдонора.

Для трансдукции необходимо особое физиологическое состояние клеткитреципиента – компетентность. Это состояние присуще активно делящимся клеткам, в которых идут процессы репликации собственных нуклеиновых кислот.

В таких клетках действует фактор компетенции – это белок, который вызывает повышение проницаемости клеточной стенки и цитоплазматической мембраны, поэтому фрагмент ДНК может проникать в такую клетку.

Конъюгация – прямой перенос фрагмента ДНК от донорских бактериальных клеток к реципиентным при непосредственном контакте этих клеток. Для реализации процесса необходим F-фактор — плазмида, кодирующая информацию, необходимую для конъюгации.

Трансдукция – это передача генетической информации между бактериальными клетками с помощью умеренных фагов. Трансдукция оказывается возможной, если в процессе размножения фага одна из фаговых частиц случайно захватит фрагмент бактериальной хромосомы, содержащий гены.

139

Когда такой фаг заразит бактериюреципиент, бактериальная ДНК донора проникает в клетку вместе с ДНК фага.

Между трансдуцированной бактериальной ДНК и гомологичным участком бактериальной хромосомы может произойти обмен, и, как следствие его, возникают рекомбинанты, несущие небольшую часть генетического материала клетки-донора.

38. Понятие об эпидемическом процессе, как условии существования возбудителей инфекционных заболеваний. Звенья эпидемического процесса.

Эпидемический процесс - это процесс распространение инфекции от больного к здоровому. При этом каждое очередное заражение обусловливается участием трех обязательных звеньев, связанных между собой в определенной последовательности.

Этими звеньями являются:

1)источник заражения (человек или животное),

2)факторы передачи возбудителя,

3)восприимчивый организм (не имеющий иммунитета против данной инфекции).

Инфекция - это состояние зараженности организма патогенными микробами, при котором происходит противоборство между микроорганизмом (возбудитель болезни) и макроорганизмом (человек). Внедрение патогенного микроба в организм человека приводит к возникновению процесса, который развивается в определенной последовательности и включает сложный комплекс биохимических, морфологических и других изменений. Эти изменения, происходящие в зараженном организме, называются инфекционным процессом.

Динамика инфекционного процесса имеет цикличность и складывается из 4 периодов.

1.Инкубационный - от момента внедрения патогенного возбудителя до первых признаков болезни. Длительность этого периода разнообразная: от нескольких часов (грипп, чума) до нескольких дней (дизентерия, брюшной тиф) и даже месяцев и лет (СПИД, проказа). В этот период происходит размножение и накопление микробов и их токсинов.

2.Продромальный (предвестников) - это период, который длится до появления характерных симптомов данной болезни. Например, при кори и натуральной оспе - первые 3 дня (до появления типичной сыпи).

3.Период разгара болезни - апогей инфекционного процесса. Длится от нескольких дней до нескольких недель. Характеризуется проявлением главных признаков болезни.

4.Период выздоровления - исчезновение симптомов болезни. При благоприятном течении болезнь может заканчиваться либо кризисом, т. е. быстрым исчезновением симптомов болезни, либо лизисом - постепенным ослаблением заболевания.

Источники заражения.

1.Человек. Инфекционные болезни, которые поражают только людей, называются антропонозы. Например, брюшным тифом, корью, дизентерией, холерой болеют только люди.

2.Животные. Большую группу заразных болезней человека составляют зоонозы, при которых источником инфекции служат различные виды домашних и диких млекопитающих и птиц. К зоонозам относятся туберкулез, бруцеллез, сибирская язва, салмонеллез и др.

Факторы передачи возбудителя.

1. Через воздух -передаются корь, грипп, эпидемический паротит, ветряная оспа и др. 2.Через воду - брюшной тиф, дизентерия, холера, туляремия, бруцеллез, сибирская язва.

3.Через почву - столбняк, ботулизм, газовая гангрена, кишечные инфекции, глисты .

4.Через пищевые продукты - все кишечные инфекции, а также могут передаваться возбудители дифтерии, скарлатины, чумы и др.

140