2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Микробиология от Насти
.pdfИммуноэлектрофорез — сочетание метода электрофореза и иммунопреципитации: смесь антигенов вносится в лунки геля и разделяется в геле с помощью электрофореза.
Затем в канавку параллельно зонам электрофореза вносят иммунную сыворотку, антитела которой, диффундируя в гель, образуют в месте «встречи» с антигеном линии преципитации.
Реакция флоккуляции по Рамону— появление хлопьевидной массы в пробирке при реакции токсин– антитоксин или анатоксин–антитоксин. Ее применяют для определения активности антитоксической сыворотки или анатоксина.
Билет 7 1. Внутривидовые отличия микроорганизмов. Понятие о биоварах (серовар, генотип,
хемовар и др.). Методы изучения внутривидовой изменчивости. (5)
Бактерии обладают высокой изменчивостью. Для внутривидовой дифференциации бактерий, отличающихся по определенному признаку, используют понятие “вариант” («вар»). Вид не является конечной единицей систематики. Внутри вида выделяют варианты микроорганизмов, отличающиеся отдельными признаками. Различают: 1) морфовары (отличие по морфологии); 2) резистентовары (отличие по устойчивости, например к антибиотикам); 3) биовары (отличие по биологическим свойствам); 4) серовары (по антигенной структуре); 5) хемовары (по чувствительности к химическим веществам); 6) фаговары (по чувствительности к фагам); 7) ферментовары; 8) бактериоциновары (по синтезу бактериоцинов – в-в, губительно действующих на другие м/о); 9) бактериоциногеновары (по чувствительности к бактериоцинам).
Для идентификации и типирования бактерий используют фенотипические, генотипические и филогенетические показатели.
Фенотипические: окраска по Граму, морфологические и культуральные свойства, биохимические реакции, хромогенные ферментативные реакции, использование источников углевода, антибиотикограмма, бактериоцинотипирование, фаготипирование, антигенные свойства, химический состав клеточной стенки (пептидогликан, миколовая кислота и др.), а также белков и липидов клетки. Генотипические: соотношение G+C, гибридизация ДНК, молекулярное зондирование, плазмидный анализ, полиморфизм длины фрагментов рестрикции ДНК, риботипирование. Филогенетические: анализ рРНК-последовательности, РНК-РНК-гибридизация, амплификация полиморфной ДНК с использованием производных праймеров, секвенирование 16S и 23S рРНК.
2. Понятие об инфекции, инфекционном процессе, инфекционном заболевании. Участники инфекционного процесса. (40)
Инфекция – это состояние зараженности, возникающее в результате проникновения м-ов в макроорганизм.
Инфекционный процесс – это динамика взаимодействия между микро- и макроорганизмом. Инфекционная болезнь – это одна из форм инфекции (инфекционного процесса) или это болезнь, вызванная микроорганизмами, эволюционно приспособившимися к паразитированию в макроорганизме. Если возбудитель и организм животного (хозяин) встречаются, то это почти всегда приводит к инфекции или инфекционному процессу, но не всегда – к инфекционной болезни с ее клиническими проявлениями.
Формы инфекции:
1.Инфекционная болезнь – наиболее яркая, клинически выраженная форма инфекции. Патологический процесс характеризуется определенными клиническими и патологоанатомическими признаками.
2.Скрытая инфекция (бессимптомная, латентная) – инфекционный процесс внешне (клиничски) не проявляется.
3.Иммунизирующая субинфекция – попавший в организм возбудитель вызывает специфические иммунные реакции, сам погибает или выводится; организм при этом не становится источником возбудителя инфекции, и функциональные нарушения не проявляются.
4.Микробоносителъство – возбудитель инфекции присутствует в организме клинически здорового животного. Макро- и микроорганизм находятся в состоянии некоего равновесия. Скрытая инфекция и микробоносительство – это не одно и то же. При скрытой инфекции можно определить периоды (динамику) инфекционного процесса (возникновение, течение и угасание), а также развитие иммунологических реакций.
Для возникновения инфекционной болезни необходимо сочетание следующих факторов:
21
1.наличия микробного агента;
2.восприимчивости макроорганизма;
3.наличия среды, в которой происходит это взаимодействие.
Формы течения инфекционной болезни:
1.Сверхострое - животное погибает из-за быстро развивающейся септицемии или токсинемии. Длительность: несколько часов.
2.Острое течение. Длительность: от одного до нескольких дней. Типичные клинические признаки при этой форме проявляются бурно.
3.Подострое течение. Длительность: более длительно, чем острое. Типичные клинические признаки при этой форме менее выражены. Патологоанатомические изменения характерны.
4.Хроническое течение. Длительность: может затянуться на месяцы и даже годы. Такое течение болезнь принимает, когда возбудитель не обладает высокой вирулентностью или организм оказывается достаточно резистентным к инфекции.
5.Абортивное течение. - развитие болезни внезапно останавливается (обрывается) и наступает выздоровление. Длительность: абортивно протекающая болезнь кратковременна. Проявляется в легкой форме. Типичные клинические признаки выражены слабо, или вообще отсутствуют.
Периоды (динамика) инфекционной болезни:
1-й период – инкубационный (скрытый) – от момента проникновения возбудителя в организм до появления первых, еще не ясных клинических признаков.
2-й период – предклинический (продромальный, предвестников болезни) – продолжается от момента появления первых, неясных, общих клинических признаков до их полного развития.
3-й период – клинический (полного развития болезни, разгара болезни) – сопровождается развитием основных клинических признаков, характерных для данной болезни.
4-й период – угасания (клинического выздоровления, реконвалесценции). 5-й период – полного выздоровления.
Факторы возникновения и исхода инфекционного процесса:
1.количественные и качественные характеристики микроорганизмов – определяют специфичность инфекционного процесса.
2.состояние макроорганизма, его восприимчивость к микроорганизму – определяет форму проявления, длительность, тяжесть и исход данного инфекционного процесса.
3.факторы внешней среды, где происходит встреча микроорганизма с хозяином – оказывает опосредованное воздействие, снижая или повышая восприимчивость хозяина или инфицирующую дозу и вирулентность возбудителя.
Стадии инфекционного процесса:
1.Проникновение микроорганизма в макроорганизм, его адаптация в месте входных ворот, адгезия и колонизация.
2.Образование ферментов, токсинов и др. продуктовв процессе жизнедеятельности и размножения микроорганизмов, что приводит к нарушению гомеостаза за счет местного и генерализованного воспаления.
3.Диссеминацияза пределы первичного очага, а следовательно генерализация инфекции.
4.Формирование защитной реакции макроорганизма– направлено на нейтрализацию микроорганизма и его токсинов, восстановление гомеостаза.
5.Восстановление гомеостаза – выздоровление и приобретение невосприимчивости к микроорганизму – иммунитета.
3. Возбудители сальмонеллезов. Таксономия и биологическая характеристика. Эпидемиология и патогенез заболеваний. Микробиологический диагноз сальмонеллезов. Лечение. (103)
Острая кишечная зоонозная инфекция, вызываемая сероварами сальмонелл, характеризующаяся поражением ЖКТ.
Морфологические свойства: подвижные, грам «-» палочки, капсулы нет. Хорошо растут на простых питательных и желчесодержащих средах. На плотных – образуют колонии в R-и S-формах, на жидких – помутнение. На лактозособержащих средах образуют бесцветные колонии.
Биохимическая активность: ферментация глк. до кислоты и газа, отсутствие ферментации лактозы, продукция сероводорода, отсутствие индолообразования.
22
Антигенная структура: соматический О-антиген, жгутиковый Н-антиген, Некоторые – К-антиген. Род Salmonellaсостоит из двух видов — вида S. enterica, в который включены все сальмонеллы, являющиеся возбудителями человека и теплокровных животных, и вида S. bongori, который подразделяется на 10 сероваров. Вид S. entericaразделен на 6 подвидов, которые подразделены на серовары.
Некоторые серовары сальмонелл, в частности S. Typhi, имеют полисахаридный Vi-антиген, являющийся разновидностью К-антигена.
Эпидемиология.Возбудителями сальмонеллеза является большая группа сальмонелл, входящая в подвид enterica. Наиболее часто возбудителями сальмонеллезов у человека являются серовары S. Typhimurium, S. Dublin, S. Choleraesuis. Основные факторы передачи — мясо, молоко, яйца, вода.
Патогенез и клиника.Заболевание протекает в локальной форме гастроэнтерита, ведущий синдром - диарейный. Инвазировав слизистую тонкого кишечника через М-клетки и проникнув в подслизистую, сальмонеллы захватываются макрофагами, переносясь ими в пейеровы бляшки, где формируют первичный очаг инфекции. При этом выделяются эндотоксин и белковый энтеротоксин. Энтеротоксин активирует поступление в просвет кишечника большого количества жидкости, К,Na. Понос, рвота.
Иммунитет: Ненапряженный, серовароспецифический, опосредован секреторным IgA, который предотвращает процесс пенетрации сальмонеллами слизистой тонкого кишечника. В крови могут определяться антитела.
Микробиологическая диагностика.Бактериологическому исследованию подвергают рвотные массы, промывные воды желудка, испражнения, желчь, мочу, кровь.
При идентификации выделенных культур необходим широкий набор диагностических О- и Н- сывороток.
Для серологического исследования применяют РНГА, ИФА. Важное диагностическое значение имеет нарастание титра антител в динамике заболевания.
Лечение.Применяется патогенетическая терапия, направленная на нормализацию водно-солевого обмена. При генерализованных формах — этиотропная антибиотикотерапия. Сальмонеллезные групповые, адсорбированные О- и Н-агглютинирующие сыворотки. Применяются для установления серогрупп и сероваров сальмонелл в реакции агглютинации. Сальмонеллезные О- и Н- монодиагностикумы представляют собой взвеси сальмонелл, убитых нагреванием (О-диагностикумы) или обработкой формалином (Н-диагностикумы). Применяются для серодиагностики брюшного тифа. Профилактика. Специфическая профилактика сальмонеллеза у с/х животных и птиц. Неспецифическая профилактика - проведение ветеринарно-санитарных мероприятий.
4. Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам. (76)
Метод стандартных индикаторных дисков– он позволяет охарактеризовать культуру бактерий, выделенную от больного, как устойчивую, умеренно устойчивую, умеренно чувствительную, чувствительную или высоко чувствительную к тому или иному антибиотику.
1)Для этого из суточной чистой культуры со скошенного агара готовят бактериальную взвесь густотой 5×108 м.т./мл и засевают 1 мл, нанося на всю поверхность специальной твердой питательной среды АГВ, разлитой в чашки Петри.
2)Посев подсушивают 20-30 минут и накладывают на него стандартные маркированные бумажные диски, содержащие определенную концентрацию того или иного антибиотика.
3)Диски накладывают на расстоянии не менее 10 мм от края чашки и 20 мм друг от друга.
4)Посевы инкубируют в термостате. Через 24 часа измеряют диаметр зон задержки роста вокруг дисков. В зависимости от его величины (d в мм) культуру относят к той или иной группе чувствительности.
5)Антибиотики, к которым данный штамм бактерий оказался высоко чувствительным, и рекомендуются для лечения.
Метод серийных разведений – позволяет определить мин. ингибир. концентрацию (МИК) данного антибиотика для данного штамма.
1)В ряд пробирок разливают МПБ в объеме 1 мл, а в первую – 1,9 мл.
2)В отделльной пробирке готовят матричный р-р антибиотика с высок. конц-ей.
3)Из нее в первую пробирку вносят 0,1 мл, перемеш. и переносят 1 мл в след. пробирку,ее встряхивают и переносят 1 мл из нее в след. и т. д.
4)Из послед.пробирки ряда по окончании приготовления разведения 1 мл выливают.
23
5)Затем во все пробирки вносят 0,1 мл взвеси сут. культуры со скошеш.агара =>термостат(37°С на 24 ч)
6)Ч/з сутки исслед. посевы и отмечают наим. концентрацию антибиотика, вызвавш. задержку рост-это
(МИК).
В контр. пробирке(без антибиотика) бактерии размножаются, вызывая помутнение бульона.
При постановке опыта на плотной среде:
1)по 20 мл расплавл. МПА разливают в неск. флаконов и в каждый добавл.опред. кол-ва антибиотика, перемеш. и разливают по чашкам Петри.
2)После застывания среды производят посевы испыт. культур=>термостатм(37°С на 24 ч). 3)Ч/з сутки исслед. посевы и определяют МИК.
Билет 8 1. Тинкториальные свойства бактерий. Техника приготовления и методы окраски микропрепаратов. (7)
Тинкториальные свойства – это способности одноклеточных, бактерий или грибов вступать в реакцию с красителями и окрашиваться в тот или иной цвет.
Морфологические и тинкториальные свойства бактерий изучают с помощью микроскопии.
При простом методе используется одно окрашивающее вещество (фуксин, метиленовая синька и др.) с экспозицией 1- 2 минуты. После окрашивания краситель сливают, препарат промывают и высушивают.
Окраска простым способом позволяет выявить наличие или отсутствие м/о, его форму, расположение клеток, определить размеры.
Сложные методы окраски выявляют химические и структурные особенности м/о, при этом обычно последовательно применяют несколько красителей. Красители: кислотные (кислые, протоплазматические), нейтральные и щелочные (основные, ядерные).
Из кислых красителей используют:
-красные красители: фуксин кислый, эозин, эритрозин, конго красный;
-желтые красители: пикриновая кислота, конго;
-черные красители: нигрозин.
Из основных красителей чаще применяют:
-красные красители: фуксин основной феноловый, сафранин, нейтральный красный, пиронин;
-фиолетовые красители: метиловый фиолетовый, генциановый фиолетовый, кристаллический фиолетовый;
-синие красители: метиленовый синий, метиленовый голубой, азур II, виктория;
-зеленые красители: малахитовый зеленый, метиленовый зеленый;
-желто-коричневые красители: везувин, хризоидин.
Вработе используют как спиртовые, так и водные растворы красителей. Спиртовые растворы более устойчивы.
Вводные растворы для усиления действия красителя к нему добавляют протравляющее вещество
(формалин, фенол), которое способствует разрыхлению клеточной оболочки и лучшему прокрашиванию микробов.
Препараты изготавливают из живых или убитых (фиксированных и окрашенных) бактерий. В качестве материала используют кровь, мокроту, гной, фекалии и другой инфицированный материал от больного, а также чистую культуру бактерий, выросшую на питательных средах. Из них готовят мазок. Из пораженных органов и тканей можно приготовить мазок-отпечаток.
Для приготовления препаратов используют предметные стекла.
Для длительного сохранения препаратов и при приготовлении препаратов “раздавленная капля”
используют покровные стекла. Стекла должны быть чистыми и хорошо обезжиренными. Их хранят в спирте или смеси Никифорова (спирт+эфир). Перед приготовлением препарата стекло прожигают в пламени спиртовки. После употребления стекла погружают на 1-2 ч в конц. H2SO4 или хромовую смесь, промывают, кипятят в 5% рре соды 30 мин, ополаскивают и сушат.
24
Препараты живых микробов используют для изучения размеров, формы клеток, их подвижности и других признаков.
Недостатки: низкая контрастность живых клеток, невозможность длительного наблюдения. После микроскопирования живых патогенных бактерий препарат погружают в дезраствор. Микроскопирование лучше осуществлять в темном поле.
Метод “раздавленная капля”. На середину предметного стекла наносят бактериологической петлей или пастеровской пипеткой каплю физраствора. В эту каплю вносят культуру бактерий и тщательно перемешивают. Накрывают покровным стеклом: краем прикасаются к поверхности предметного отекла рядом с каплей, наклоняют покровное стекло над каплей и опускают его.
Следят за тем, чтобы не образовались пузырьки воздуха. Излишки жидкости убирают фильтровальной бумагой.
Если требуется рассматривать препарат продолжительное время, то края покровного стекла предварительно смазывают вазелином.
Метод “висячая капля”. Для длительного (в течение 1-2 суток) изучения процессов размножения, спорообразования и др. Используют предметное стекло с лункой. На середину покровного стекла наносят каплю жидкой культуры микроба. Края лунки смазывают вазелином. Предметное стекло переворачивают лункой вниз, прижимают его к покровному стеклу, чтобы капля оказалась в центре лунки. После этого препарат переворачивают.
Капля должна свободно свисать в лунку, не соприкасаясь с его дном и краями.
Приготовление окрашенных препаратов.
1.Приготовление мазка на предметном стекле (физраствор+бактерии).
2.Высушивание мазка на воздухе.
3.Фиксация препарата.
4.Окрашивание мазка.
5.Высушивание препарата на воздухе.
Приготовление препарата из культуры с плотной питательной среды.
На середину обезжиренного предметного стекла наносят каплю физраствора.
Прожигают бактериологическую петлю, охлаждают ее и отбирают материал (пробирка в левой руке, пробку извлекают в пламени горелки мизинцем правой руки; при отборе с чашки Петри её размещают рядом со спиртовкой, приподнимают крышку левой рукой и отбирают материал петлей).
Материал переносят в каплю, круговыми движениями перемешивают, распределяют по площади не менее 1 см2. После петлю прожигают, помещают в штатив. Препарат высушивают на воздухе.
Приготовление препарата из жидкой микробной культуры.
Бактериологическую петлю прожигают, остужают, каплю материала наносят на стекло. Отбор материала производят указанным выше способом. Круговыми движениями каплю распределяют по стеклу (не <1 см2). После петлю обжигают и помещают в штатив, а приготовленный препарат высушивают на воздухе. Можно использовать пастеровскую пипетку.
Приготовление препарата - мазка из мокроты и гноя.
Бактериологическую петлю прожигают и остужают. Материал наносят на середину предметного стекла и плотно прижимают другим предметным стеклом. Предметные стекла раздвигают в разные стороны за свободные концы. В результате этого получают два мазка.
Приготовление препарата - мазка из крови. На предметное стекло помещают каплю крови. Его кладут на горизонтальную поверхность и придерживают левой рукой; а правой рукой к капле придвигают под углом в 45° шлифованное стекло. Капля должна равномерно растекаться по краю шлифованного стекла. Плотно прижимая и не меняя угла наклона, шлифованное стекло продвигают по предметному стеклу. В результате этого на предметном стекле получается равномерный мазок. Приготовление мазка – отпечатка тканей. При исследовании патологического или трупного материала (ткань, орган) ножницы смачивают в этиловом спирте, обжигают, остужают и срезают кусочек исследуемой ткани (органа). К срезу ткани плотно прижимают предметное стекло. В результате этого на стекле остается мазок – отпечаток.
Фиксация препарата (закрепление и инактивация микробов): физический способ (над пламенем горелки), химический способ (эфир, этиловый или метиловый спирт, смесь Никифорова).
Окрашивание мазка.
•Метод по Граму:
1)На мазок кладут фильтровальную бумагу, наливают карболовый р-р генцианвиолета на 1-2 мин.
2)Снимают бумагу, наливают р-р Люголя на 1 мин.
25
3)Обесцвечивают 96%-ным спиртом 30 сек.
4)Промывают водой.
5)Красят 1-2 мин. водным р-ром фуксина.
6)Ополаскивают водой и высушивают.
Грамположительные – фиолетовые, грамотрицательные – красные.
•Метод по Цилю-Нильсену:
1)Мазок покрывают бумагу, наносят карболовый фуксин Циля и несколько раз подогревают до появления паров, подливая краситель.
2)Бумагу снимают, обесцвечивают 5%-ным р-ром H2SO4.
3)Промывают водой.
4)Окрашивают р-ром метиленового синего 3-5 мин.
5)Промывают водой, высушивают.
Клеточная стенка кислотоустойчивых бактерий содержит много липидов. Они с трудом окрашиваются, но затем удерживают основной краситель при обесцвечивании кислотой. Некислотоустойчивые бактерии легко окрашиваются, а затем легко обесцвечиваются кислотой и окрашиваются дополнительным красителем.
Кислотоустойчивые - рубиново-красные, некислотоустойчивые - сине-голубые.
·Метод по Ожешко:
1)Протрава HCl при нагревании в течение 2-3 мин (разрыхляет оболочку споры, которая плохо окрашивается).
2)Фиксация мазка.
3)Окрашивание по Цилю-Нильсену.
Цитоплазма клетки – синяя, споры – красные.
·Метод по Бурри-Гинсу
1)На предметном стекле каплю черной туши смешивают с каплей культуры петлёй (по Бурри).
2)Делают мазок по типу кровяного.
3)Высушивают на воздухе, фиксируют.
4)Окрашивают карболовым фуксином 5 мин (по Гинсу).
5)Промывают водой, высушивают.
Капсулы, имея консистенцию геля, плохо удерживают краситель, их исследуют методом негативного контрастирования.
Бактерии – красные, капсулы – неокрашенные на темном фоне.
·Метод по Морозову (вирусы, жгутики)
1)Обрабатывают кислотой 1 мин. (жгутики разрыхляются).
2)Промывают водой.
3)Закрепляют танином, подогревая, 1 мин.
4)Обрабатывают азотнокислым серебром 1-2 мин.
5)Промывают водой, высушивают.
При обработке аммиачным раствором серебра эта соль восстанавливается в исследуемом объекте и окрашивает его.
Жгутики – светло-жёлтые, микробная клетка – тёмно-коричневая, капсиды вирионов – не окрашиваются, фон препарата — бесцветный или светло-жёлтый.
·Метод по Романовскому-Гимзе (нуклеоид, риккетсии, хламидии, спирохеты, клетки крови)
1)Мазки высушивают на воздухе, фиксируют метиловым спиртом 3 мин.
2)Высушивают, окрашивают смесью азура, эозина и метиленового синего при t =37 C 20-30 мин. в закрытой чашке Петри с увлажнённым фильтром на дне.
3)Промывают, высушивают.
Цитоплазма бактерий – бледно-розовая, цитоплазма клеток – голубая, ядра – красно-фиолетовые.
· Метод окраски по Нейссеру
1) Мазок окрашивают уксуснокислой синей 1 минуту.
2)Промывают водой и наливают р-р Люголя на 20-30 секунд.
3)Окрашивают везувином 1-3 мин.
4)Промывают водой, высушивают.
Тела бактерий - нежные светло-коричневые, зерна волютина – в темно-синие, почти черные.
Порядок микроскопирования:
26
1)Зеркало микроскопа устанавливают в соответствии с освещением и под малым увеличением и поднятом конденсоре регулируют освещенность поля зрения.
2)На препарат капают каплю иммерсионного масла и устанавливают его на предметный столик.
3)Обычный объектив микроскопа заменяют на иммерсионный (х90).
4)Наблюдая сбоку, макровинтом
опускают тубус до соприкосновения иммерсионного объектива с маслом.
5)Наблюдая в окуляр, определяют контуры микробных клеток микровинтом до ясного изображения. Изучают препарат.
6)Поднимают тубус, убирают препарат. Объектив протирают мягкой салфеткой, смоченной бензином.
7)Револьвер устанавливают в нейтральное положение, подкладывают под него салфетку, опускают
револьвер и конденсор.
2. Учение о санитарно-показательных микроорганизмах. (48)
Основными источниками распространения возбудителей большинства инфекционных болезней,
поражающих человечество, являются люди и теплокровные животные. Наиболее массивное выделение происходит воздушно-капельным и фекальными путями.
Санитарно-микробиологическое исследование объектов окружающей среды говорит о наличии или отсутствии в них опасных для человека микроорганизмов.
Непосредственное обнаружение возбудителя инфекционных болезней имеет целый ряд трудностей. Во-первых, патогенные микроорганизмы находятся в окружающей среде постоянно – сравнительно легко их можно обнаружить в период эпидемии или иной инфекции, но очень трудно в межэпидемические периоды. Основная же деятельность санитарных микробиологов направлена на предупреждение возникновения эпидемий и поэтому вся работа ведется в межэпидемические периоды. Во-вторых, количество патогенных микроорганизмов, попавших в окружающую среду, значительно уступает непатогенным и распространение их в загрязненных объектах неравномерно. Отрицательные результаты индикации патогенных микроорганизмов не говорят об их отсутствии. Поэтому приходится подходить к оценке различных объектов. И чем обильнее это загрязнение, тем более вероятно попадание в объект патогенных микробов.
Сообщающиеся с внешним миром полости тела людей и животных обильно заселены нормальной микрофлорой. Для многих видов микроорганизмов (обитателей тела здорового человека) полость рта или кишечник являются биотопами – единственной средой обитания. Находя в исследуемом материале представителей микрофлоры полости рта, предполагаем о попадании слизи из дыхательных путей, в которой могут содержаться и возбудители скарлатины, туберкулеза и др., а, обнаруживая нормальных обитателей кишечника, мы можем делать заключение о наличии фекального загрязнения и возможной опасности присутствия брюшнотифозных, дизентерийных палочек, возбудителей кишечных инфекций. Выделяемые в этих случаях микробы служат показателями санитарного неблагополучия, потенциальной опасности исследуемых объектов, и поэтому названы «санитарно-показательными».
Требования к санитарно-показательным микроорганизмам:
1.Они должны постоянно содержаться в выделениях человека и теплокровных животных и поступать в окружающую среду в больших количествах.
2.Они не должны иметь другого природного резервуара, кроме организма человека и животных. 3.После выделения в окружающую среду они должны сохранять жизнеспособность в течение сроков, близких к срокам выживания патогенных микробов, выводимых из организма теми же путями. 4.Они не должны размножаться в окружающей среде.
27
5.Они не должны сколько-нибудь значительно изменять свои биологические свойства в окружающей среде.
6.Они должны быть достаточно типичными, с тем, чтобы их дифференциальная диагностика осуществлялась без особого труда.
7.Индикация, идентификация и количественный учет должны производится доступными и экономичными микробиологическими методами.
Преимущество кишечных палочек, связано с их свойствами, которые соответствуют основным требованиям: они являются постоянными обитателями кишечника человека и животных, выделяются в окружающую среду с фекалиями, их выживаемость и устойчивость в окружающей среде несколько превышает подобные свойства патогенных энтеробактерий, они не обладают способностью размножаться ни в почве, ни в воде. В загрязненных объектах количество их превалирует над всей остальной кишечной флорой. Являются основным показателем фекального загрязнения и, косвенным индикатором эпидемической опасности объектов окружающей среды.
Обнаружение энтерококков подтверждает факт свежего фекального загрязнения, так как они быстрее отмирают в окружающей среде и в то же время более устойчивы к действию пестицидов и детергентов.
В категорию санитарно-показательных (индикаторных) микроорганизмов включены представители кишечной микрофлоры человека: БГКИ, фекальные кишечные палочки (ФКП), к
которым в основном относятся E.coli, бактерии группы протея, клостридии (C.perfringens), Е. faecalis, колифаги.
Показателями биологического загрязнения воздуха помещений являются стрептококки и стафилококки.
Одним из микроорганизмов, который составляет основную анаэробную флору кишечника человека, являются бифидобактерии. Однако трудности при индикации и культивировании анаэробных бифидобактерий отдаляют их практическое использование как индикатора биологической контаминации.
3. Стрептококки. Таксономия и биологическая характеристика. Эпидемиология и патогенез заболеваний. Роль в патологии человека. Микробиологическая диагностика стрептококковых инфекций. Лечение. (106)
Характеристика возбудителей. Стрептококки относятся семейству Streptococcaceae роду Streptococcus. Являясь условнопатогенными бактериями, они могут вызывать гнойно-воспалительные процессы у ослабленных людей. Наибольшее медицинское значение представляют S. pyogenes (от
греч. pyon — гной, genos — рождать) и S. pneumoniae (пневмококки).
Морфология. Стрептококки — слегка вытянутые шаровидные клетки размером 0,5–2,0 мкм, располагающиеся попарно или цепочками. Клеточная стенка состоит из пептидогликанового, полисахаридного и протеинового слоев. Грамположительные, спор не образуют, неподвижны, многие образуют капсулу. Способны образовывать L-формы.
Культуральные свойства. Факультативные анаэробы, некоторые капнофилы.
Оптимальная температура роста 35–37 С. Лучше растут на средах, обогащенных углеводами с добавлением крови или сыворотки при рН 7,2–7,4. Образуют мелкие серовато-прозрачные колонии. На кровяном агаре стрептококки вызывают гемолиз: D-гемолиз (характерен для зеленящих стрептококков)
— зеленовато-серый или коричневый гемолиз вокруг колоний; E-гемолиз — полный гемолиз вокруг колоний; J-гемолиз — отсутствие видимого гемолиза.
Ферментативная активность. Представители S. pyogenes расщепляют сахара
(глюкозу, мальтозу, лактозу, манит, сахарозу, салицин, трегалозу) с образованием молочной кислоты. Не ферментируют инулин, крахмал; не разжижают желатин; не восстанавливают нитраты в нитриты; растворяют фибрин; не лизируются в желчесодержащих средах, устойчивы к оптохину.
Антигенная структура сложная. Классификация по Р. Ленсфилд основана на наличии специфических полисахаридов в клеточной стенке стрептококков;
выделяют 20 серогрупп от А до V. В патологии человека основная роль принадлежит стрептококкам группы А.
По специфичности белковых антигенов клеточной стенки: М-протеина (нитевидные выросты), Т- протеина (термолабильный) и F-протеина (фибронектинсвязывающий белок) — стрептококки внутри групп подразделяются на серовары.
Факторы патогенности.
28
Наиболее значимыми ферментами стрептококков являются:
1)стрептокиназа (фибринолизин) превращает плазминоген в плазмин — активный протеолитический фермент, разрушающий фибрин и другие протеины, тем самым разрушая кровяные сгустки, способствует распространению бактерий в тканях (ее используют для разрушения тромбов);
2)стрептодорназа (стрептококковая дезоксирибонуклеаза) — деполимеризует ДНК гноя, разжижая его;
3)гиалуронидаза (фактор распространения) — расщепляет гиалуроновую кислоту, основной компонент соединительной ткани, способствуя распространению стрептококков по макроорганизму;
4)С5а-пептидаза — расщепляет и инактивирует С5а-компонент комплемента (хемоаттрактант).
Из экзотоксинов стрептококков важное значение имеют:
пирогенный экзотоксин (эритрогенный экзотоксин — эритрогенин) продуцируется лизогенными стрептококками, вызывающими скарлатину и синдром стрептококкового токсического шока (STSS); является суперантигеном, действие которого подобно действию стафилококкового токсина синдрома токсического шока;
гемолизины (стрептолизины) двух типов: стрептолизин О (O — англ. oxygen) и стрептолизин S
(S — от англ. stable).
Первый чувствителен к кислороду, вызывает гемолиз в глубине кровяного агара в условиях анаэробиоза, разрушает лейкоциты, тромбоциты и эритроциты. Против него вырабатываются
антитела антистрептолизины О, блокирующие гемолиз, вызванный этим стрептококковым токсином.
Стрептолизин S устойчив к кислороду, вызывает поверхностный гемолиз на кровяном агаре, разрушает эритроциты, лейкоциты, тромбоциты; неиммуногенен.
Патогенез. С инфекционным синдромом связывают развитие на месте внедрения возбудителя инфекции очагов серозного, гнойного или некротического воспаления. Благодаря наличию факторов проницаемости проникать в регионарные лимфатические узлы, вызывая развитие лимфаденита. Проникновение возбудителя в кровяное русло и возникновение гематогенных очагов: остеомиелита, эндокардита, менингита или септикопиемии с множественными гнойными очагами в различных органах и тканях.
Токсический синдром характеризуется лихорадкой, тахикардией, рвотой, головной болью, бредом. Клиника. Стрептококковые инфекции подразделяют на острые (скарлатина, рожа, ангина, импетиго, острый гломерулонефрит, острый эндокардит, послеродовый сепсис) и хронические заболевания (ревматизм, хронический тонзиллит).
Эпидемиология. Стрептококки — представители нормофлоры организма человека и животных. Источник инфекции — человек или животные. Стрептококки как условно-
патогенные микробы. Восприимчивость к стрептококкам повышена у иммунокомпромиссных лиц, при вторичном иммунодефиците. Основной путь передачи стрептококка – воздушно капельный, кроме того возможен контактно-бытовой путь - через грязные руки, загрязненный предметы ухода за больными.
Проникновение в организм чаще происходит через слизистую оболочку дыхательных путей (96-97%), возможно заражение через поврежденную кожу или через пупочную ранку у новорожденных. Лечение. При лечении учитывают чувствительность большинства стрептококков, особенно S. pyogenes, к пенициллинам, макролидам и хлорамфениколу.
Профилактика в основном неспецифическая: соблюдение санитарно-гигиенического режима, правил асептики, антисептики, дезинфекции и стерилизации
Лабораторная диагностика
Возбудитель S. pyogenes.
Материал – пунктат из ограниченных очагов воспаления (абсцессы и др.), мазок из слизистой зева и носа, раневое отделяемое, моча, спинномозговая жидкость, рвотные массы, промывные воды желудка.
Бактериологический метод.
1 день. Посев материала тампоном на кровяной агар (КА). Для накопления культуры пептонный бульон с 1% глюкозой (сахарный бульон). Инкубируют при 37ºС 18 ч (КА, МПБ).
2 день. На КА: бесцветные колонии. Отмечают наличие или отсутствие гемолиза вокруг колонии: α – гемолиз – зеленая зона гемолиза; β – гемолиз – прозрачная зона гемолиза; γ – гемолиз – отсутствие видимого гемолиза. Из ½ части подозрительной колонии готовят мазок, окрашивают по Граму. Обнаруживаются грам (+) кокки.
29
3 день. Проводят видовую идентификацию микроорганизма. Изучение биохимических свойств: Со скошенного КА ставят пробы: - редукция метиленовой сини в молоке; - рост на среде с 40% желчью; - рост на среде с рН 9,0; - рост на энтерококковом агаре; - наличие гемолиза; -
ферментация оптохима; Определяют чувствительность к антибиотикам.
Серологический метод. ПЦР – диагностика.
4. Иммуноферментный анализ (ИФА). Механизм, компоненты, применение. (88)
ИФА— иммуноферментный анализ.
Иммуноферментный анализ — выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, бета-галактозидазой или щелочной фосфатазой).
После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат расщепляется ферментом и изменяется цвет продукта реакции — интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. ИФА применяют для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных болезней, в частности для диагностики ВИЧ-инфекций, гепатита В и др., а также определения гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и других биологически активных веществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концентрациях (1010 -1012 г/л).
Твердофазный ИФА— вариант теста, когда один из компонентов иммунной реакции (антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе, напр., в лунках планшеток из полистирола. Компоненты выявляют добавлением меченых антител или антигенов. При положительном результате изменяется цвет хромогена. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшиеся реагенты путем промывания,
I. При определении антител (левый рисунок) в лунки планшеток с сорбированным антигеном последовательно добавляют сыворотку крови больного, антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом, и субстрат/хромоген для фермента.
II. При определении антигена (правый рисунок) в лунки с сорбированными антителами вносят антиген (напр., сыворотку крови с искомым антигеном), добавляют диагностическую сыворотку против него и вторичные антитела (против диагностической сыворотки), меченные ферментом, а затем субстрат/хромоген для фермента.
Конкурентный ИФА для определения антигенов: искомый антиген и меченный ферментом антиген конкурируют друг с другом за связывание ограниченного количества антител иммунной сыворотки. (рис 1)
Другой тест - Конкурентный ИФА для определения антител: искомые антитела и меченные ферментом антитела конкурируют друг с другом за антигены, сорбированные на твердой фазе.
Иммуноблоттинг — высокочувствительный метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА. Иммуноблоттинг используют как диагностический метод при ВИЧинфекции и др. Антигены возбудителя разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят их из геля на активированную бумагуили нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Фирмы выпускают такие полоски с «блотами» антигенов. На эти полоски наносят сыворотку больного. Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом.
30