Глава 8. Приложения

8.4 Исходные растворы и среды

Для приготовления всех растворов, используемых для исследования функции сперматозоидов in vitro, требуется очищенная вода (дистиллированная, бидистиллированная или деионизированная H2O) (для сред, используемых для тканей, предназначаемых для целей вспомогательной репродукции, следует использовать воду соответствующего качества для выращивания клеточных культур). В настоящем издании не рекомендуется использовать среду Хэма F10 с учетом ее известного негативного воздействия на сперматозоиды, их функцию и, возможно, на результаты исследования (431).

При работе со сперматозоидами решающее значение имеют pH (обычно pH 7,4) и осмолярность среды.

8.4.1 Буферирование pH среды

pH культуральной среды можно контролировать с помощью буферных молекул, чаще всего HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота), или стандартной 25 мМ бикарбонатной буферной системы. Бикарбонатное буферирование обеспечивает такое же равновесие, как и кислотно-основной гомеостатический механизм в живых тканях; в его процессе углекислый газ (CO2) взаимодействует с водой (H2O) с образованием угольной кислоты (H2CO3), которая, в свою очередь, быстро диссоциирует на бикарбонат-ион (HCO3-) и ион водорода (H+), как видно из следующей реакции равновесия:

CO2+H2O H2CO3 HCO3−+H+

Добавление 25 мМ бикарбоната в среду, уравновешенную правильным процентным содержанием CO2, позволяет закрепить/буферизировать pH среды.

Следует отметить, что правильное процентное содержание CO2 для получения pH 7,4 зависит от парциального давления CO2 и поэтому, что особенно важно, изменяется в зависимости от положения над уровнем моря. Поэтому часто упоминаемые 5% CO2 актуальны только на уровне моря, и для достижения правильного pH следует проводить местную корректировку (компенсацию) pCO2 (через посредство процентного содержания CO2) (432).

8.4.2 Приготовление среды и осмоляльность

Осмолярность11 или осмоляльность12 среды имеет решающее значение для поведения в ней любых клеток. Поэтому эту ключевую переменную необходимо учитывать, если среда приготавливается собственными силами, а не приобретается на коммерческой основе. Ее также всегда следует запрашивать/определять при покупке любой коммерческой среды.

Стандартной для эякулята является среда в диапазоне 280–295 мОсм (миллиосмолей) (кроме раствора для теста с использованием

11Количество осмотических частиц на объем растворителя.

12Количество осмотических частиц на массу растворителя. Когда растворителем является вода, осмолярность и осмоляльность практически идентичны.

263

Лабораторное руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека, шестое издание

гипоосмотического набухания). До достижения необходимой осмолярности с помощью описанных составов обычно производится конечный объем, а затем медленно добавляется ингредиент в избытке, как правило, безводный хлорид натрия. Это является предпочтительным вариантом в случае, если для этих измерений имеется осмометр. В представленных формулах предлагается «приготовить до 1000 мл», поэтому при отсутствии осмометра возможно близкое приближение.

Вместе с тем необходимо помнить, что осмоляльность быстро увеличивается in vitro в эякулятах, собранных в контейнер для образцов и оставленных для разжижения. Сперматозоиды in vitro приспосабливаются к повышению осмоляльности, и это означает, что воздействие среды с осмоляльностью 280– 290 мОсм на адаптированных сперматозоидов приводит к их относительному гипоосмотическому шоку, что может снизить подвижность и результаты ЦГП (147).

8.4.3 Спецификации химических веществ/ ингредиентов среды

Ниже приведены химические вещества с их наиболее распространенными уровнями гидратации при покупке. Некоторые химические вещества, например CaCl2, могут быть доступны с разными уровнями гидратации (например безводный CaCl2; CaCl2•2H2O и CaCl2•6H2O). Если используется вещество с другим уровнем гидратации, измеренные веса должны быть соответствующим образом скорректированы для достижения правильной молярности. Необходимо также отметить, что многие из этих химических веществ гигроскопичны, поэтому крайне важно обеспечить их правильное хранение и соблюдать сроки годности – в противном случае будет получена неправильная среда.

Предполагается, что химические вещества, используемые для этих исследований, должны как минимум обладать качеством, необходимым для выращивания клеточных культур.

Во многие перечисленные среды требуется добавлять сыворотку. Как правило, для диагностических сред предлагается добавлять BSA (фракция V), обычно поставляемый в виде сухого порошка, поскольку он является более дешевым, стабильным и широко доступным заменителем сыворотки человека. Для таких исследований, как оценка акросомной реакции, в рамках которой оценивается воздействие на функции, сыворотка всегда должна быть без жирных кислот/обезжиренной древесным углем, чтобы повысить однородность партии и избежать воздействия загрязняющих веществ, таких как гормоны. В лабораториях, выполняющих эти исследования на регулярной основе, следует проводить тестирование партий.

Если сперматозоиды используются для лечения, то для применения in vivo всегда следует использовать проверенную сыворотку человека (обычно поставляемую в жидком виде). Необходимо соблюдать соответствующие условия хранения и сроки годности.

Среды с феноловым красным в составе имеют эту добавку в качестве простого полезного индикатора pH, который помогает визуально распознать значительные изменения pH. Если планируется проведение флуоресцентных анализов, то обычно рекомендуется отказаться от фенолового красного, поскольку он повышает фоновую флуоресценцию сперматозоидов и среды.

264

Глава 8. Приложения

8.4.4 Среда Biggers, Whitten and Whittingham (BWW)

8.4.4.1 Исходный раствор BWW (433)

1.К 1000 мл очищенной воды добавьте 5,54 г хлорида натрия (NaCl), 0,356

г хлорида калия (KCl), 0,294 г гептагидрата сульфата магния (MgSO4•7H2O), 0,250 г дигидрата хлорида кальция (CaCl2•2H2O) и 0,162 г дигидрофосфата калия (KH2PO4).

2.Доведите pH до 7,4 с помощью 1 моль/л гидроксида натрия (NaOH).

3.Добавьте феноловый красный из расчета 1,0 мл (0,04%, 0,4 г/л) на литр.

Этот раствор можно хранить несколько недель при 4°C.

8.4.4.2 Рабочий раствор BWW

В день использования:

1. Добавьте в 100 мл исходного раствора 210 мг бикарбоната натрия (NaHCO3), 100 мг D-глюкозы, 0,37 мл 60%-ного (v/v) концентрата лактата натрия, 3 мг пирувата натрия, 350 мг альбумина бычьей сыворотки (фракция V), 10 000 единиц пенициллина и 10 мг сульфата стрептомицина.

2.Перед использованием нагрейте до 37°C в атмосфере 5% (v/v) CO2, 95% (v/v) воздуха.

3.Для инкубации на воздухе: добавьте 20 ммоль/л HEPES (соль Na: 5,21 г/л) и уменьшите содержание NaHCO3 до 10 ммоль/л (28).

8.4.5 Фосфатно-солевой буферный раствор Дюльбекко (DPBS)

1.Глюкоза-PBS Дюльбекко: к 750 мл очищенной воды добавьте 0,2 г хлорида

калия (KCl), 0,2 г дигидрофосфата калия (KH2PO4), 0,1 г гексагидрата хлорида магния (MgCl2•6H2O), 8,0 г хлорида натрия (NaCl), 2,16 г гептагидрата гидрофосфата динатрия (Na2HPO4•7H2O) и 1,00 г D-глюкозы.

2.Растворите 0,132 г дигидрата хлорида кальция (CaCl2•2H2O) в 10 мл очищенной воды и медленно добавьте к вышеуказанному раствору при перемешивании.

•Для предотвращения выпадения осадка добавляйте CaCl2 отдельно, медленно и при перемешивании.

3.Доведите pH до 7,4 с помощью 1 моль/л (равно 1 М или 1 N) гидроксида натрия (NaOH).

4.Доведите объем до 1000 мл с помощью очищенной воды.

•При необходимости добавьте перед использованием альбумин бычьей сыворотки (фракция V) из расчета 0,3 г на 100 мл.

265

Лабораторное руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека, шестое издание

8.4.6 Сбалансированный солевой раствор Эрла (EBSS)

1.К 750 мл очищенной воды добавьте 6,8 г хлорида натрия (NaCl), 2,2 г

бикарбоната натрия (NaHCO3), 0,14 г моногидрата дигидрофосфата натрия (NaH2PO4•H2O), 0,4 г хлорида калия (KCl), 0,20 г гептагидрата сульфата магния (MgSO4•7H2O) и 1,0 г D-глюкозы.

2.Медленно растворите 0,23 г хлорида кальция (CaCl2•H2O) в вышеуказанном растворе при перемешивании.

3.Доведите pH до 7,4 с помощью 1 моль/л соляной кислоты (HCl) или 1 моль/л гидроксида натрия (NaOH).

4.Доведите объем до 1000 мл с помощью очищенной воды.

5.Для инкубации на воздухе: добавьте 20 ммоль/л HEPES (соль Na: 5,21 г/л) и уменьшите содержание NaHCO3 до 10 ммоль/л (Mortimer and Mortimer, 2014).

8.4.7 Дополненный сбалансированный солевой раствор Эрла (sEBSS)

1.К 750 мл очищенной воды добавьте 6,8 г хлорида натрия (NaCl), 2,2 г

бикарбоната натрия (NaHCO3), 0,14 г моногидрата дигидрофосфата натрия (NaH2PO4•H2O), 0,4 г хлорида калия (KCl), 0,20 г гептагидрата сульфата магния (MgSO4•7H2O) и 1,0 г D-глюкозы.

2.Медленно растворите 0,23 г хлорида кальция (CaCl2•H2O) в вышеуказанном растворе при перемешивании.

3.Добавьте 3 г альбумина бычьей сыворотки (фракция V).

4.Добавьте 0,30 г пирувата натрия.

5.Добавьте лактат натрия (обычно в виде концентрата D,L-молочной кислоты натрия) до конечной концентрации 19 мМ.

6.Доведите объем до 1000 мл с помощью очищенной воды.

8.4.8 Human tubal fluid (жидкость маточной трубы человека) (HTF)

Первоначальный состав сформулирован в документе Куин и др. (434):

1. К 750 мл очищенной воды добавьте 5,931 г хлорида натрия (NaCl), 0,35 г хлорида калия (KCl), 0,05 г гептагидрата сульфата магния (MgSO4•7H2O), 0,05 г дигидрофосфата калия (KH2PO4), 2,1 г бикарбоната натрия (NaHCO3), 0,5 г D-глюкозы, 0,036 г пирувата натрия, 0,3 г хлорида кальция (CaCl2•2H2O) и 4,0 г DL-лактата натрия (60%-ный (v/v) концентрат)13.

2.К 1 мл вышеуказанной среды добавьте 10 мкг фенолового красного, 100 единиц пенициллина и 50 мкг сульфата стрептомицина.

13В некоторых опубликованных составах в качестве источника лактата используется лактат кальция (29).

266

Глава 8. Приложения

3.Доведите pH до 7,4 с помощью 1 моль/л соляной кислоты (HCl).

4.Доведите объем до 1000 мл с помощью очищенной воды.

5.Для инкубации на воздухе: добавьте 20 ммоль/л HEPES (соль Na: 5,21 г/л) и уменьшите содержание NaHCO3 до 10 ммоль/л.

8.4.9 Трис-буферный солевой раствор (TBS)

1.К 750 мл очищенной воды добавьте 6,055 г трис-основания и 8,52 г хлорида натрия (NaCl).

2.Доведите pH до 8,2 с помощью 1 моль/л соляной кислоты (HCl).

3.Доведите объем до 1000 мл с помощью очищенной воды.

8.4.10 Раствор Тироде

1.К 750 мл очищенной воды добавьте 0,2 г безводного хлорида кальция

(CaCl2), 0,2 г хлорида калия (KCl), 0,05 г гидрофосфата динатрия (Na2HPO4), 0,2 г гексагидрата хлорида магния (MgCl2•6H2O), 8,0 г хлорида натрия (NaCl), 1,0 г бикарбоната натрия (NaHCO3) и 1,0 г D-глюкозы.

2.Доведите pH до 7,4 с помощью 1 моль/л соляной кислоты (HCl) или 1 моль/л гидроксида натрия (NaOH).

3.Доведите объем до 1000 мл с помощью очищенной воды.

4.При необходимости добавьте перед использованием альбумин бычьей сыворотки (фракция V) из расчета 0,3 г на 100 мл.

8.4.11 Краситель по Папаниколау

В продаже имеются красители, как правило, удовлетворительного качества, но его можно также приготовить в лаборатории.

Примечание. Проверьте кислотность очищенной воды перед приготовлением разных концентраций этанола. pH должен составлять 7,0.

8.4.11.1 EA-36 (эквивалент EA-50)

267

Лабораторное руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека, шестое издание

Исходные растворы Приготовьте отдельные 10%-ные (100 г/л) растворы каждого из красителей следующим образом:

1.Растворите 10 г эозина Y в 100 мл очищенной воды.

2.Растворите 10 г Бисмарка коричневого Y в 100 мл очищенной воды.

3.Растворите 10 г светло-зеленого SF в 100 мл очищенной воды.

Приготовление

1.Для приготовления 2 литров красителя смешайте перечисленные выше исходные растворы следующим образом:

•50 мл эозина Y

•10 мл Бисмарка коричневого Y

•12,5 мл светло-зеленого SF.

2.Доведите объем до 2000 мл с помощью 95%-ного (v/v) этанола.

3.Добавьте 4 г фосфорновольфрамовой кислоты.

4.Добавьте 0,5 мл насыщенного раствора углекислого лития.

5.Тщательно перемешайте и храните при комнатной температуре в темнокоричневых плотно укупоренных бутылках.

Примечание 1. Раствор остается стабильным в течение 2–3 месяцев.

Примечание 2. Перед использованием пропустите через фильтр с порами 0,45 мкм.

8.4.11.2 Оранжевый G6

268

Глава 8. Приложения

Исходный раствор № 1 (оранжевый G6, 10%-ный (100 г/л) раствор)

1.Растворите 10 г кристаллов оранжевого G в 100 мл очищенной воды.

2.Хорошо встряхните. Перед использованием дайте постоять в темнокоричневой или покрытой алюминиевой фольгой бутылке при комнатной температуре в течение 1 недели.

Исходный раствор № 2 (оранжевый G6, 0,5%-ный раствор)

1.К 50 мл исходного раствора № 1 добавьте 950 мл 95%-ного (v/v) этанола.

2.Добавьте 0,15 г фосфорновольфрамовой кислоты.

3.Тщательно перемешайте. Храните в темно-коричневых или покрытых алюминиевой фольгой бутылках с пробками при комнатной температуре.

Примечание 1. Перед использованием отфильтруйте.

Примечание 2. Раствор остается стабильным в течение 2–3 месяцев.

8.4.11.3 Гематоксилин Харриса без уксусной кислоты

Компоненты

•Гематоксилин (темные кристаллы; цветовой индекс 75290)

•95%-ный (v/v) этанол

•Додекагидрат сульфата алюминия-аммония (AlNH4(S4O2)•12H2O)

•Окись ртути (HgO).

Приготовление

1.Растворите 160 г сульфата алюминия-аммония в 1 600 мл очищенной воды при нагревании.

2.Растворите 8 г кристаллов гематоксилина в 80 мл 95%-ного (v/v) этанола.

3.Добавьте раствор гематоксилина к раствору сульфата алюминия-аммония.

4.Нагрейте смесь до 95°C.

5.Снимите смесь с нагревательного прибора и медленно добавьте 6 г окиси ртути при перемешивании.

Примечание. Раствор будет темно-фиолетового цвета.

6.Сразу же погрузите контейнер в емкость с холодной водой.

7.Когда раствор остынет, отфильтруйте.

8.Храните в темно-коричневых или покрытых алюминиевой фольгой бутылках при комнатной температуре.

269