Глава 8. Приложения

кислорода в воздухе может снизиться, что создаст риск удушья. Существуют кислородные детекторы, которые подают сигнал тревоги, когда уровень кислорода падает ниже 17% (v/v), и их следует использовать в местах хранения жидкого азота.

•Используйте только пробирки и соломины, специально изготовленные для замораживания в жидком азоте. Следует всегда соблюдать осторожность, так как даже они могут взорваться по мере нагревания.

•Весь персонал, задействованный в криогенных процедурах с использованием жидкого азота, должен пройти соответствующее обучение. Для руководителей, ответственных за данную область, соответствующее обучение должно быть организовано внешней стороной или поставщиком оборудования для жидкого азота.

8.3 Микроскопия для базового исследования эякулята

8.3.1 Справочная информация

Лучшим источником информации для конкретного микроскопа является руководство производителя, которое должно содержать схему с указанием всех деталей. При отсутствии такого руководства информацию о настройке и использовании микроскопа можно найти в Интернете.

Для выполнения оценок эякулята, описанных в настоящем руководстве, рекомендуется использовать фазово-контрастный микроскоп. Микроскоп предпочтительно должен быть бинокулярным (иметь два окуляра), с фазовым конденсором; он должен быть оснащен фазовыми объективами ×10, ×20 (или ×25) и ×40 (или ×63) (для общей оценки, оценки подвижности и подсчета сперматозоидов и других клеток) и светосильным объективом ×100 с масляной иммерсией (для оценки морфологии и жизнеспособности).

•Качество и цена объективов значительно различаются. Более дорогие объективы дают лучшее изображение, но и менее качественные объективы могут быть вполне пригодными. Следует учитывать, что при использовании высококачественных объективов лабораторная работа может приводить к меньшему напряжению для глаз сотрудников.

•Окулярныесетки(окулярныешкалы,окулярныемикрометры)–этостеклянные диски с нанесенными на них шкалами известных размеров, обычно 5 мм или 10 мм, или сетками различных форм. Некоторые окуляры имеют постоянно установленные сетки; другие можно открутить, чтобы вставить сетку. Сетки бывают разных диаметров и должны точно соответствовать диаметру окуляра. Они могут быть откалиброваны с помощью микрометра для определения размеров сперматозоидов. Сетки также используются для ограничения области поля, оцениваемой на предмет подвижности сперматозоидов. Сетка, показанная на рис. 2.4 на стр. 32 и рис. 8.4 на стр. 277, имеет размер 5 мм × 5 мм, что является подходящим размером для оценки подвижности сперматозоидов при увеличении как ×20, так и ×40. Некоторые лаборанты отдают предпочтение этой сетке вместо сетки 10 мм × 10 мм и при оценке концентрации или морфологии.

257

Лабораторное руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека, шестое издание

•Объект-микрометр представляет собой модифицированное предметное стекло микроскопа с выгравированной на его поверхности шкалой, обычно 1 мм, и ценой каждого деления 10 мкм. Он может использоваться для калибровки окулярного микрометра или сетки, а также для оценки параметров, например при исследовании подвижности сперматозоидов (рис. 8.5 на стр. 277).

Описанная ниже процедура обеспечивает получение наиболее оптимального изображения под микроскопом. Если световой поток правильно выровнен и отрегулирован, изображение будет ясным, четким и с меньшей вероятностью вызовет напряжение глаз. При использовании нового микроскопа или получении изображений плохого качества необходимо выполнить нижеследующие процедуры.

Рис 8.2 Устройство микроскопа

Окуляр/окулярная линза Диоптрическая коррекция

258

Глава 8. Приложения

8.3.1.1 Линза объектива

На каждую линзу микроскопа нанесена информация, такая как:

Plan: планарная линза, обеспечивающая плоское поле зрения, в котором все находится в фокусе.

Apo: апохроматическая линза с высокой коррекцией хроматических аберраций.

F, Fl, FL, Neofluor, Fluo, Fluotar, UV, S-Fluor: линза, пропускающая ультрафиолетовые лучи.

100×, 63×, 40× и т.д.: увеличение линзы.

0.30, 0.50, 0.80, 1.30, 1.40 и т.д.: числовая апертура (NA) линзы. Это показатель светособирающей способности линзы. Вместе с длиной волны используемого света NA определяет разрешение (кратчайшее расстояние между двумя объектами, которые можно различить как отдельные). Для получения наилучшего разрешения выбирайте наибольшее значение NA.

Ph, Ph1, Ph2, Ph3, NP, N: обозначает линзу с фазовым кольцом. Ph обозначает кольца с положительной фазой, а NP или N – с отрицательной. Для линз Ph1, Ph2 и Ph3 требуются разные фазовые кольца в конденсоре. Оптика с положительным фазовым контрастом позволяет наблюдать внутриклеточные структуры (используется для влажных препаратов и оценки подвижности), а оптика с отрицательным фазовым контрастом дает белые изображения на темном фоне (используется для оценки жизнеспособности во влажных препаратах и для CASA).

Imm, immersion, oil, W: обозначает линзу, предназначенную для работы с жидкостью – часто маслом, водой (W) или глицерином, – находящейся между объектом и линзой, для получения более четкого изображения. (Если это не указано, линза является «сухой» и не должна использоваться с жидкостью.)

Iris: обозначает линзу с диафрагмой, управляемой кольцом с насечкой.

Corr: обозначает линзу с коррекционным кольцом с насечкой, позволяющим использовать иммерсионные среды с различными показателями преломления.

160, ∞: длина тубуса или расстояние между окуляром и объективом. Раньше это расстояние обычно составляло 160 мм, но в большинстве современных линз оно равно бесконечности (∞).

0.17, –: толщина покровного стекла, необходимая для объектива. Для большинства целей подходят покровные стекла № 1,5 (толщина 0,16–0,19 мм). Для гемоцитометров необходимы покровные стекла № 4 (толщина 0,44 мм). «–» означает, что толщина покровного стекла не имеет значения или что

259

Лабораторное руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека, шестое издание

иммерсионная жидкость может быть добавлена непосредственно на предметное стекло.

WD:рабочее расстояние – это расстояние от переднего элемента линзы объектива до ближайшей поверхности покровного стекла, при котором образец находится в четком фокусе. WD обычно уменьшается по мере возрастания увеличения и NA, и в этой связи рабочее расстояние объектива может быть нормальным (NWD, до 5 мм), длинным (LWD, 5,25–9,75 мм), сверхдлинным (ELWD, 10–14 мм) и супердлинным (SLWD, 15 мм). При работе с усовершенствованной камерой Нейбауэра для некоторых микроскопов может потребоваться линза LWD.

Показатель преломления: степень фазовой задержки света при прохождении через среду. Показатель преломления (RI, ) вакуума равен 1,0000, воздуха – примерно 1,0 (1,0008), воды – 1,33, глицерина – 1,47, а большинства иммерсионных масел – 1,515. Среды для заключения препаратов после высыхания имеют RI (1,488–1,55), аналогичный RI стекла (1,50–1,58).

8.3.2 Настройка микроскопа

8.3.2.1 Установка образца или объект-микрометра для правильной фокусировки

1.Поместите 10 мкл эякулята на предметное стекло микроскопа, накройте покровным стеклом 22 мм × 22 мм (толщина № 1,5, 0,17 мм) и установите предметное стекло на предметном столике. Для настройки микроскопа вместо предметного стекла с эякулятом можно также использовать объектмикрометр.

2.Включите свет и настройте его на интенсивность, обеспечивающую максимальную контрастность и при этом комфортную для глаз.

Примечание. Если микроскоп тринокулярный (т.е. имеет третий окуляр, к которому можно присоединить камеру для фотоили видеосъемки), на нем имеется ручка отклонения света, которая обычно расположена справа от окуляров. Эта ручка, скорее всего, имеет три настройки: одна позволяет направить весь свет на окуляры, вторая – на камеру, а третья позволяет отклонить половину света на окуляры, а половину направить на камеру.

3.Выберитеобъективсположительнойфазой×10.Повернитеколесоконденсора до обеспечения соответствия с мощностью выбранного объектива.

8.3.2.2 Регулировка окуляров

Раздвигайте или сдвигайте окуляры, чтобы отрегулировать расстояние между ними под свои глаза.

260

Глава 8. Приложения

8.3.2.3 Фокусировка изображения

1.Поверните ручку грубой фокусировки, чтобы приблизить предметный столик как можно ближе к объективу ×20 или ×40. Во избежание поломки объектива или предметного стекла смотрите на объектив и предметный столик спереди или сбоку, а не через окуляры. С помощью грубой фокусировки отрегулируйте высоту столика так, чтобы предметное стекло почти соприкасалось с объективом. Обратите внимание, в какую сторону следует повернуть ручку грубой фокусировки, чтобы отодвинуть столик от объектива.

2.Глядя в оба окуляра, медленно поворачивайте ручку грубой фокусировки, постепенно отодвигая столик от объектива до тех пор, пока образец не окажется в приблизительном фокусе. Используйте ручку тонкой фокусировки для достижения наилучшего фокуса.

Примечание. Если фокус трудно найти, попробуйте сфокусироваться на матовых краях предметного стекла, с тем чтобы приблизиться к правильной фокальной плоскости.

8.3.2.4 Фокусировка окуляров

У некоторых микроскопов оба окуляра можно фокусировать независимо друг от друга. У других микроскопов один окуляр фиксированный, а другой можно фокусировать.

1.Регулируемые окуляры обычно маркируются шкалой «+ / 0 / –». Перед началом этого процесса установите окуляр на «0».

2.Если один окуляр фиксированный, смотрите только через него (закройте или прикройте другой глаз).

3.Сфокусируйте изображение образца с помощью ручки тонкой фокусировки. Полезно сфокусироваться на каком-либо неподвижном предмете, например на мертвом сперматозоиде, частице пыли или сетке объект-микрометра.

4.Сфокусируйте регулируемый окуляр, глядя через него и закрыв или прикрыв глаз над фиксированным окуляром. Вращайте кольцо с насечкой у основания окуляра в сторону «+» или «–» до тех пор, пока фокус не станет подходящим для вашего глаза.

8.3.2.5 Фокусировка светового конденсора

1.Закройте диафрагму осветителя поля (над источником света в основании микроскопа).

2.Поднимайте или опускайте конденсор с помощью маленьких ручек слева или справа от блока конденсора, пока края диафрагмы не окажутся в максимально четком фокусе, а круг света не станет маленьким и четким. Это положение обычно достигается, когда конденсор находится в крайнем верхнем положении. Край светового изображения может меняться от синего к красному по мере фокусирования конденсора (хроматическая аберрация), а края конденсора будут оставаться слегка размытыми. Свет может быть отцентрирован или не отцентрирован.

261

Лабораторное руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека, шестое издание

Примечание. Если апертура поля не имеет ирисовой диафрагмы, сфокусируйтесь на каком-либо остром предмете (например острие карандаша), помещенном на источник света.

8.3.2.6 Центрирование конденсора

1.Отцентрируйте диафрагму осветителя поля с помощью ручек для центрирования конденсора. Как правило, эти две ручки (обычно с насечкой) находятся по диагонали спереди или сбоку под конденсором.

2.Как только световое изображение будет отцентрировано, откройте диафрагму осветителя поля таким образом, чтобы свет падал только на поле зрения. Не открывайте диафрагму дальше этого уровня.

3.Закрывайте диафрагму конденсора до тех пор, пока не исчезнут блики.

8.3.2.7 Регулировка фазовых колец

Это делается с помощью центрирующего телескопа, который можно приобрести у производителя микроскопа.

1.Приведите в поле зрения фазовое кольцо в конденсоре, соответствующее используемому объективу.

2.Снимите один окуляр и замените его центрирующим телескопом. Сфокусируйте кольцо центрирующего телескопа, глядя в него и одной рукой держась за его основание, а другой рукой вращая его верхнюю часть. Вращайте ее до тех пор, пока два кольца не окажутся в четком фокусе: одно кольцо темное (фазовое кольцо), а другое светлое (световое кольцо).

3.Выровняйте эти кольца таким образом, чтобы они были концентрическими, поворачивая ручки регулировки фазы, расположенные на фазовом конденсоре. Эти ручки обычно находятся на задней стороне конденсора.

4.Замените центрирующий телескоп окуляром микроскопа.

8.3.2.8 Флуоресцентная микроскопия

Флуоресцентная микроскопия используется для обнаружения ядер сперматозоидов при проведении чувствительной процедуры подсчета с использованием красителя Hoechst 33342 (раздел 3.1 на стр. 94) и оценки акросомной реакции с использованием лектина, меченного FITC (раздел 4.2.2 на стр. 163). Спектральные максимумы возбуждающего излучения красителя Hoechst 33342 и FITC составляют 346 нм и 494 нм соответственно, а соответствующие максимумы эмиссионного излучения – 460 нм и 520 нм. Необходима флуоресцентная линза (раздел 8.3.1.1 на стр. 259). Каждая модель микроскопа имеет в качестве дополнительного оборудования необходимый набор дихроических зеркал и барьерных фильтров, необходимых для исследований с применением этих красителей.

262