Глава 5. Методы подготовки сперматозоидов

5.3.2 Процедура

1.Тщательно перемешайте образец эякулята.

2.Разведите весь образец эякулята 1+1 (1 : 2) средой, чтобы способствовать удалению семенной плазмы.

3.Перенесите разведенную суспензию в несколько центрифужных пробирок, предпочтительно не более 3 мл в каждую пробирку.

4.Центрифугируйте при 300–500g в течение 5–10 минут.

5.Осторожно аспирируйте и удалите супернатант.

6.Ресуспендируйте смешанный осадок сперматозоидов в 1 мл среды осторожным пипетированием.

7.Центрифугируйте снова при 300–500g в течение 3–5 минут.

8.Осторожно аспирируйте и удалите супернатант.

9.Ресуспендируйте осадок сперматозоидов осторожным пипетированием в объеме среды, подходящем для окончательного предназначения, например для инсеминации.

Число отмываний для удаления семенной плазмы может быть уменьшено за счет использования меньшего числа пробирок и увеличения объема препарата в каждой пробирке. В этом случае следует увеличить центробежную силу и продолжительность центрифугирования, с тем чтобы обеспечить полное осаждение сперматозоидов, например при 500–600g в течение 8–10 минут. Обратите внимание, что центробежная сила зависит от радиуса и количества оборотов в минуту (об/мин) (расчет центробежных сил см. в разделе 8.2.2 на стр. 253).

5.4 Прямое всплытие

Сперматозоиды могут быть отобраны по их способности выплывать из семенной плазмы в культуральную среду. Этот метод известен как «всплытие» («swim-up»). Перед проведением процедуры всплытия эякулят предпочтительно не разводить и не центрифугировать, поскольку это может привести к пероксидативному повреждению мембран сперматозоидов (348). Таким образом, прямое всплытие сперматозоидов из эякулята является предпочтительным методом для отделения подвижных сперматозоидов (например, 45, 46). Метод прямого всплытия предполагает либо наслоение культуральной среды на разжиженный эякулят, либо формирование слоя разжиженного эякулята под культуральной средой. Затем подвижные сперматозоиды перемещаются в культуральную среду. Эта процедура приводит к получению меньшего числа сперматозоидов, чем отмывание, но позволяет отобрать их с точки зрения подвижности, и ее целесообразно проводить в тех случаях, когда процентная доля подвижных сперматозоидов в эякуляте низкая, например для ЭКО и ИКСИ.

187

Лабораторное руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека, шестое издание

5.4.1 Реагенты

•BWW,EBSSилиsEBSS(раздел8.4настр.263),обогащенныепредпочтительно HSA или сывороткой, как описано ниже.

•HSA, высокоочищенный и свободный от вирусного, бактериального и прионного загрязнения и эндотоксинов.

•Обогащение HSA: к 50 мл среды добавьте 300 мг HSA, 1,5 мг пирувата натрия, 0,18 мл лактата натрия (60%-ный (v/v) концентрат) и 100 мг бикарбоната натрия.

•Обогащение сывороткой: к 46 мл среды добавьте 4 мл термоинактивированной (при 56°C в течение 20 минут) сыворотки пациента, 1,5 мг пирувата натрия, 0,18 мл лактата натрия (60%-ный (v/v) концентрат) и 100 мг бикарбоната натрия.

5.4.2 Процедура

1.Тщательно перемешайте образец эякулята.

2.Поместите 1 мл эякулята в стерильную коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл и осторожно нанесите на него 1,2 мл среды. В качестве альтернативного метода осторожно пипетируйте эякулят под культуральную среду.

3.Наклоните пробирку под углом около 45°, с тем чтобы увеличить площадь поверхности раздела эякулята и культуральной среды, и инкубируйте в течение 1 часа при 37°C.

4.Аккуратно верните пробирку в вертикальное положение и снимите верхний слой среды объемом 1 мл. В нем будут содержаться высокоподвижные сперматозоиды.

5.Разведите его 1,5–2,0 мл среды.

6.Центрифугируйте при 300–500g в течение 5 минут и удалите супернатант.

7.Ресуспендируйте осадок сперматозоидов в 0,5 мл среды для оценки концентрации, общей подвижности и прогрессивной подвижности сперматозоидов (раздел 2.4.6 на стр. 27 и раздел 2.4.8 на стр. 33).

8.Образец может быть использован непосредственно в терапевтических или исследовательских целях.

5.5 Прерывистые градиенты плотности

Прерывистые градиенты плотности могут быть использованы в качестве эффективного и адаптируемого метода для сбора высококачественных сперматозоидов для ВРТ. Этот метод может обеспечить надлежащий отбор подвижных сперматозоидов, свободных от других типов клеток и дебриса. Его легче стандартизировать, чем метод всплытия, и поэтому результаты получаются более стабильными. Этот метод используется для извлечения и подготовки сперматозоидов для проведения ЭКО и ИКСИ.

188

Глава 5. Методы подготовки сперматозоидов

В рамках этого метода проводится центрифугирование эякулята в градиентах плотности, состоящих из коллоидной окиси кремния с силановым покрытием, которые разделяют клетки только по их плотности. Наиболее широко применяется простой двухэтапный метод подготовки сперматозоидов путем центрифугирования в прерывистом градиенте плотности. Необходимо следоватьрекомендациямпроизводителей(см.84).Подготовкасперматозоидов с помощью центрифугирования в градиенте плотности (ЦГП) обычно позволяет получить фракцию высокоподвижных сперматозоидов, свободных от дебриса, загрязняющих лейкоцитов, неполовых клеток и дегенерирующих половых клеток.

Имеется ряд коммерческих продуктов для создания градиентов плотности, пригодных для обработки эякулята. Любое отступление от рекомендаций по процедуре должно быть обосновано. Большинство сред с градиентом плотности содержат компоненты с высокой относительной молекулярной массой, которые имеют изначально низкую осмоляльность, поэтому их обычно готовят в среде, изоосмотической по отношению к жидкостям женских половых путей.

5.5.1 Реагенты и процедура

Приготовьте и используйте градиент в соответствии с инструкциями производителей, как упоминалось выше. Следует соблюдать осторожность при приготовлении больших объемов градиента, поскольку он подвержен загрязнению микроорганизмами. В случае обнаружения микроорганизмов под микроскопом градиент необходимо удалить в отходы.

5.6 Сортировка клеток с магнитной активацией (MACS)

Появление ВРТ, особенно с учетом случаев, когда требуется извлечение сперматозоидов для искусственного оплодотворения, например для проведения ИКСИ в случае бесплодия по мужскому фактору, способствовало разработке дополнительных исследований в области оптимизированного извлечения функциональных сперматозоидов без значительного повреждения ДНК.

Кокрейновский систематический обзор (358) не выявил различий в вероятности наступления клинической беременности и живорождений после применения MACS и после использования сперматозоидов, отобранных методом связывания с гиалуроновой кислотой (HA-ICSI) или с помощью других методов отбора. Кроме того, после ЦГП наблюдается повышенная фрагментация ДНК, что приводит к снижению вероятности наступления беременности у пар, прибегающих к ЭКО/ИКСИ (354).

5.6.1 Реагенты и оборудование для извлечения сперматозоидов методом MACS

•Буферный раствор HEPES, модифицированный HTF.

•Аннексин V-конъюгированные микросферы или микрогранулы.

189

Лабораторное руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека, шестое издание

•Набор аннексин V-конъюгированных микрогранул (Miltenyi Biotec, Huburn, CA, USA; MACS Good Manufacturing Practice (GMP) Annexin V kit, Miltenyi Biotec, Germany).

•Разделительная колонка или магнит, оснащенный железным шариком (Mini MACS, Miltenyi Biotec).

•Пробирки Эппендорфа (1,5 мл).

•Центрифуга.

•Инкубатор.

5.6.2 Процедура

1.Аликвоту эякулята объемом 0,5 мл суспендируют в буферном растворе HEPES, модифицированном HTF, который получают после отмывания сперматозоидов для удаления семенной плазмы или перед ЦГП, когда добавляется дополнительная процедура.

2.Центрифугируйте и суспендируйте осадок в 80 мкл связывающего буферного

раствора с 20 мкл аннексин V-конъюгированных микросфер (Annexin V microbead kit, Miltenyi Biotec, Huburn, CA, USA) в течение 15 минут при комнатной температуре.

3.Добавьте 400 мкл связывающего раствора и поместите в разделительную колонку, и немеченые (жизнеспособные) клетки пройдут через колонку.

4.Немеченую фракцию извлекают и обрабатывают, как описано выше (359).

5.7 Подготовка образцов ВИЧ-инфицированного эякулята

Если в эякуляте присутствует вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), вирусная рибонуклеиновая кислота (РНК) и провирусная ДНК могут быть обнаружены в свободном виде в семенной плазме и клетках, не относящихся к сперматозоидам. По результатам систематического обзора и метаанализа (360), охватывающего 11 585 циклов ВРТ с использованием отмытых сперматозоидов среди 3994 женщин из ВИЧ-дискордантных пар, 56,3% достигли клинической беременности, и у них не происходило сероконверсии без вирусной супрессии

вплазме. Поскольку рецепторы ВИЧ (CD4, CCR5, CXCR4) экспрессируются только клетками, не относящимися к сперматозоидам, в качестве способа предотвращения заражения неинфицированных женщин-партнеров было предложено ЦГП в сочетании с последующим методом всплытия (361, 362), при том, что существуют и другие проверенные методы (363). Эти процедуры были разработаны для отделения инфицированных вирусом клеток, не относящихся к сперматозоидам, и семенной плазмы (в супернатанте градиента плотности) от свободных от ВИЧ подвижных сперматозоидов после всплытия (из осадка

вградиенте плотности). Перед использованием подготовленные образцы необходимо протестировать методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), и для ВРТ должны использоваться только свободные от ВИЧ образцы. Несмотря на обнадеживающие результаты, пока

190