исследования

Глава 4.

Углубленные исследования

Мужское бесплодие часто связано с недостаточной выработкой семенной жидкости, аномальной морфологией сперматозоидов, нарушением подвижности сперматозоидов или сочетанием этих причин. Такие фенотипы можно с точностью определить в рамках исследования эякулята. Вместе с тем у многих пациентов параметры эякулята, полученные в результате его исследования, представляются совершенно нормальными, и их бесплодие, скорее всего, связано с нарушением функции сперматозоидов. Механизмы, лежащие в основе нарушения функции сперматозоидов человека, остаются неизвестными. Сперматозоиды человека должны выполнить ряд сложных задач внутри женских половых путей, преодолевая расстояния в несколько сантиметров, прежде чем они получат химические и физические сигналы в отношении локализации яйцеклетки. Кроме того, сперматозоиды должны пройти стадии акросомального экзоцитоза и гиперактивированной подвижности для того, чтобы преодолеть защитные оболочки яйцеклетки. Большинство из этих навыков сперматозоиды приобретают только внутри женских половых путей в процессе созревания, называемого капацитацией. И хотя эти функции сперматозоидов необходимы для оплодотворения, ни одна из них не оценивается в рамках классического исследования эякулята.

Для более глубокого понимания биологических основ мужского фактора бесплодия был разработан целый ряд функциональных тестов, направленных на оценку способности сперматозоидов человека выполнять фундаментальные процессы, необходимые для зачатия.

157

Лабораторное руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека, шестое издание

Для устранения этого диагностического пробела необходимо передать знания

омолекулярной и клеточной физиологии сперматозоидов в клиники. Кроме того, с учетом последних публикаций, свидетельствующих о том, что изменения параметров эякулята могут быть связаны с общим состоянием здоровья человека, проведение исследований в области мужского бесплодия имеет в настоящее время фундаментальное значение (275). Более того, в настоящее время имеются фактические данные о том, что загрязнители окружающей среды в значительной мере причастны к мужскому бесплодию (276), а также к документально подтвержденному уменьшению количества сперматозоидов, наблюдаемому на протяжении последних десятилетий (277). Меньше известно о том, являются ли функции сперматозоидов, необходимые для оплодотворения, зеркалом общего состояния здоровья и влияют ли на них загрязнители окружающей среды. По мере накопления знаний о молекулярных механизмах, регулирующих функцию сперматозоидов, расширяются возможности для разработки новых диагностических тестов. Так, например, последние данные свидетельствуют

оважности уплотнения ядерной ДНК и ее целостности для определения функциональной компетентности сперматозоидов человека. Появляются данные, свидетельствующие о связях целостности ДНК и организации хроматина в сперматозоидах с фертильностью (278) (раздел 3.2 на стр. 97).

Аналогичным образом улучшенное понимание путей сигнальной трансдукции, регулирующей функцию сперматозоидов, позволит разработать диагностические тесты для получения детальной информации о точной природе процессов, нарушенных в сперматозоидах бесплодных мужчин. Для более глубокого понимания биологических основ мужского фактора бесплодия был разработан целый ряд функциональных тестов, направленных на оценку способности сперматозоидов человека выполнять фундаментальные процессы, необходимые для зачатия, такие как связывание с блестящей оболочкой, акросомальный экзоцитоз и слияние с вителлиновой мембраной ооцита.

Для некоторых тестов, проводимых в исследовательских целях, требуется отделение/отбор сперматозоидов из семенной жидкости. Такие процедуры должны проводиться как можно быстрее и не позднее чем в течение 1 часа после эякуляции, с тем чтобы ограничить любое повреждение сперматозоидов клетками, не относящимися к сперматозоидам. Кроме того, следует помнить, что классический способ сбора всего эякулята в один контейнер для образца приводит к тому, что исследуются сперматозоиды, подвергшиеся воздействию нефизиологических сред, например жидкости семенных пузырьков (251, 252)

(см. также раздел 3.9 на стр. 153).

4.1 Исследования оксидативного стресса сперматозоидов и активных форм кислорода

4.1.1 Справочная информация

На протяжении нескольких десятилетий выдвигается гипотеза о том, что дисбаланс окислительно-восстановительных реакций (REDOX) в мужских половых путях или секретах половых желез может оказывать пагубное воздействие на фертильность (279–283). Принято считать, что в основе такого пагубного воздействия лежат вырабатываемые лейкоцитами активные формы кислорода (АФК), если они присутствуют в больших количествах в семенной жидкости (раздел 3.4 на стр. 121). Вместе с тем пока еще не

158

Глава 4. Углубленные исследования

было проведено каких-либо знаковых исследований, которые позволили бы получить убедительные аргументы в пользу того или иного теста или доказать взаимосвязь между окислительно-восстановительным балансом

ирезультатами естественного или искусственного оплодотворения. Вместе с тем считается, что, по всей вероятности, оксидативный стресс является важным модулятором функции сперматозоидов человека и результатов оплодотворения (284). Поскольку одним из последствий оксидативного стресса является повреждение ДНК сперматозоидов (раздел 3.2 на стр. 97), чаще всего оценивается именно это последствие, однако существует несколько других методов исследования, которые можно использовать для более непосредственного изучения баланса между антиоксидантами

иАФК. С точки зрения клинической диагностики эту группу исследований следует использовать и интерпретировать с осторожностью до тех пор, пока не появятся более убедительные доказательства их диагностической значимости. Представленные здесь процедуры широко используются в андрологических исследованиях, а также в некоторых андрологических клинико-диагностических лабораториях и лабораториях вспомогательной репродукции. Исследования, которые могут быть использованы для оценки окислительно-восстановительного баланса или АФК, различаются как по методу, так и по типу выявляемых АФК.

4.1.2 Люминол

Этот метод основан на хемилюминесценции люминола в ходе его реакции со свободными радикалами. Уровень хемилюминесценции можно измерить с помощью люминометрии, а затем рассчитать количество относительных световых единиц (ОСЕ) на миллион сперматозоидов.

4.1.2.1 Процедура

Адаптировано из документа Диас (285):

1.Приготовьте 100 мМ исходного раствора люминола (5-амино-2,3-дигидро- 1,4-фталазиндиона), отмерив 177,1 мг люминола в полистироловую пробирку с 10 мл диметилсульфоксида (ДМСО). Заверните пробирку в алюминиевую фольгу, поскольку этот раствор чувствителен к свету. Раствор остается стабильным при комнатной температуре, но может храниться и в холодильнике.

2.Рабочие «зондовые» растворы: приготовьте 5 мМ раствора люминола в ДМСО путем разведения 20 мкл исходного раствора люминола в 380 мкл ДМСО. Этот раствор следует приготовить непосредственно перед использованием (он остается стабильным только в течение 24 часов). Раствор должен быть защищен от света.

3.Перед измерением необходимо подождать, пока эякулят станет жидким (в пределах 30 минут, но не более 1 часа в соответствии с основными методами исследования эякулята ВОЗ).

4.При использовании люминометрии измерения должны проводиться в двух препаратах (как абсолютный минимум).

159

Лабораторное руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека, шестое издание

•Для каждого эякулята готовится одна пробирка путем смешивания 390 мкл эякулята с 10 мкл рабочего «зондового» раствора. Перемешайте вихревым способом в течение 5 секунд, а затем аликвотируйте как минимум в две пробирки (или лунки в планшете).

5. Все наборы для исследования должны включать:

•холостой раствор DPBS или только среду;

•отрицательный контроль: 390 мкл DPBS или среды + 10 мкл «зондового» раствора;

•положительный контроль (в обоих случаях с добавлением 50 мкл перекиси водорода (30%-ной) + 10 мкл «зондового» раствора):

•эякулят (340 мкл) или

•DPBS или среда (340 мкл).

6.Данныеследуетрегистрироватьпорядупоказанийсодинаковыминтервалом и в порядке следования каждого аналита в соответствии с типом прибора; затем повторите и рассчитайте среднее значение.

7.Положительный контроль можно использовать для оценки чувствительности исследования в конкретных условиях с помощью серии разведений, а также для подтверждения того, что при использовании любого конкретного набора для исследования будет обнаружен значимый результат.

8.Для нормализации данных среднее значение для образца вычитается из среднего отрицательного контроля. Этот показатель может быть скорректирован на количество сперматозоидов путем деления на концентрацию сперматозоидов в миллионах на мл, но на сегодняшний день неясно, имеют ли результаты, скорректированные на количество сперматозоидов, большую значимость, чем результаты, полученные в отношении образца, и поэтому можно указывать оба результата.

4.1.2.2 Проблемы

•Люминометры, как правило, не аккредитованы для диагностики in vitro и предназначены только для исследований.

•Конструкция приборов (например в том, что касается объема образца) и, соответственно, калибровка, чувствительность, динамический диапазон и даже используемые единицы измерения значительно различаются.

•Из-за описанных различий между приборами и методологиями и низкой прогностической ценности исследований согласованных референсных значений не существует.

•Силы сдвига (перемешивание) изменяют сигнал, поэтому результаты крайне чувствительны к манипуляциям во время обращения с образцами и ко времени проведения измерения.

160

Глава 4. Углубленные исследования

•Люминол чувствителен к рН, перепадам температуры и воздействию химических веществ, часто варьирующихся в разных эякулятах, таких как аскорбиновая кислота (ослабляет сигнал) или тиол-содержащие молекулы (повышают результаты), а также к уровням других присутствующих белков.

4.1.3 Окислительно-восстановительный потенциал

Воснове этого метода лежит непосредственное измерение окислительновосстановительного баланса в образцах электрохимическими способами.

Вкачестве интегрирующего измерения комбинированного образца, для которого требуются минимальные манипуляции и которое в этой связи вполне поддается стандартизации, этот метод в настоящее время широко используется в рамках исследований субфертильности. На данный момент в продаже можно найти только один прибор, имеющий патентную защиту. В нем используются одноразовые датчики для измерения. Этот прибор следует использовать в соответствии с последними протоколами производителя, которые не рассматриваются в данном руководстве.

4.1.3.1 Проблемы

•Убедительных фактических данных в пользу этого исследования не опубликовано; в настоящее время его следует продолжать рассматривать как исследовательский тест до тех пор, пока не появятся убедительные данные, касающиеся репродуктивных исходов.

•Вязкость образца и плохое разжижение могут сказаться на его текучести и, следовательно, затруднить заполнение эталонной камеры.

•Как и для всех других исследований сперматозоидов, время для проведения этого исследования после эякуляции должно быть стандартизировано.

4.1.4 Общая антиоксидантная способность

Этотметодпредназначендляоценкиспособностивсегоэякулятауравновешивать любой оксидативный стресс. Таким образом измеряется способность антиоксидантных ферментов и систем в семенной плазме, а также любых антиоксидантов, попавших в семенную плазму из пищи или иным способом (но не в сперматозоиды; они удаляются центрифугированием). В этом исследовании присутствующие антиоксиданты ингибируют окисление 2'-азинобис-(3-этил- бензтиазолинсульфокислоты) (АБТС) катионами-радикалами. Этот тест был разработан для использования применительно к разным жидкостям организма и поэтому не является специфическим для эякулята (286). Для создания стандартного диапазона используется тролокс, аналог витамина Е (токоферола), поэтому результаты исследования обычно выражаются в микромолях тролоксэквивалента.

4.1.4.1 Процедура

1.Ввиду широкого использования этого исследования во многих системах помимо фертильности для его проведения доступны готовые наборы от

161