Глава 5. Методы подготовки сперматозоидов

еще нет достаточных фактических данных, подтверждающих устранение риска инфицирования ВИЧ в результате подготовки сперматозоидов.

Примечание. Для минимизации риска перекрестной контаминации свободных от ВИЧ образцов этот метод должен использоваться только

вучреждениях с безопасными условиями (364). Недавно полученные данные (365–368) свидетельствуют о том, что в дискордантных парах,

вкоторых достигнута вирусная супрессия, передача ВИЧ партнеру незначительна или полностью отсутствует.

5.8Подготовка сперматозоидов из ткани яичка и придатка яичка

Для сперматозоидов, извлеченных из ткани яичка и придатка яичка, требуется специальнаяподготовка.Типичнымпоказаниемдляаспирациисперматозоидов из придатка яичка является в большей мере обструктивная азооспермия, чем дисфункция яичек. Поэтому для терапевтических целей может быть собрано относительно большое количество сперматозоидов. Аспираты из придатка яичка часто могут быть получены с минимальным загрязнением эритроцитами и другими неполовыми клетками, что делает выделение и отбор подвижных сперматозоидов из придатка яичка относительно простым. При получении большого количества сперматозоидов из придатка яичка эффективным методом их подготовки для последующего использования является ЦГП (раздел 5.4 на стр. 187). При небольшом количестве сперматозоидов можно применять метод простого отмывания (раздел 5.3 на стр. 186).

Сперматозоиды из яичка могут быть получены путем открытой биопсии (с микродиссекцией или без нее) или путем чрескожной пункционной биопсии. Образцы сперматозоидов из яичек неизменно загрязнены неполовыми клетками и большим количеством эритроцитов, поэтому для получения чистого препарата сперматозоидов необходимы дополнительные шаги. Для забора связанных в семявыносящих канальцах удлиненных сперматид (сперматозоидов из ткани яичка) необходимы ферментативные или механические методы. Сперматозоиды из ткани яичка используются для ИКСИ с учетом их незначительного количества и низкой подвижности.

5.8.1 Ферментативный метод

1.Инкубируйте ткань яичка с коллагеназой (например 0,8 мг Clostridium histolyticum, тип 1A на мл среды) в течение 1,5–2 часов при 37°C, перемешивая вихревым способом каждые 30 минут.

Примечание. Ферменты могут вызвать повреждение сперматозоидов, и в случае их использования они должны быть пригодны для терапевтического применения.

2. Центрифугируйте при 100g в течение 10 минут и исследуйте осадок.

191

Лабораторное руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека, шестое издание

5.8.2 Механический метод

1.Мацерируйте ткань яичка в культуральной среде под стеклянными покровными стеклами до получения тонкой суспензии диссоциированной ткани.

2.В качестве альтернативного способа извлеките клетки из семявыносящих канальцев с помощью тонких игл (прикрепленных к одноразовым туберкулиновым шприцам), наклоняя их параллельно дну чашки для культивирования.

5.8.3 Обработка суспензии сперматозоидов для интрацитоплазматической инъекции

1.Отмойте полученные образцы, добавив 1,5 мл культуральной среды.

2.Центрифугируйте при 300g в течение 8–10 минут.

3.Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в 0,5 мл свежей культуральной среды.

4.Оцените подвижность и количество сперматозоидов в осадке. (Некоторые образцы с низким числом сперматозоидов, возможно, потребуется ресуспендировать в меньшем объеме среды.)

5.Поместите каплю культуральной среды объемом 5–10 мкл в чашку для культивирования.

6.Покройте ее минеральным маслом (предварительно уравновешенным CO2).

7.Введите 5–10 мкл суспензии сперматозоидов в культуральную среду.

8.Осторожно аспирируйте подвижные сперматозоиды, находящиеся на поверхности раздела между культуральной средой и маслом, с помощью пипетки для ИКСИ.

9.Перенесите их в каплю вязкого раствора, например, поливинилпирролидона (7–10% (100 г/л) в среде).

5.9 Подготовка образцов при ретроградной эякуляции

У некоторых мужчин при эякуляции семенная жидкость попадает в мочевой пузырь, что приводит к аспермии – отсутствию видимого эякулята. Подтверждениеэтойситуацииможнополучитьприисследованииобразцамочи после оргазма на наличие сперматозоидов. Если фармакологическое лечение невозможно или не дает результатов, сперматозоиды могут быть выделены из мочи. Подщелачивание мочи, например, путем приема бикарбоната натрия, повысит вероятность того, что какие-либо сперматозоиды, попавшие в мочу, сохранят свои характеристики подвижности (369).

192

Глава 5. Методы подготовки сперматозоидов

5.9.1 Сбор эякулята без предварительного подщелачивания мочи

В лаборатории мужчину следует попросить:

•помочиться без полного опорожнения мочевого пузыря;

•собрать эякулят путем мастурбации в контейнер для образца; и

•снова помочиться во второй контейнер для образца, содержащий культуральную среду (для дальнейшего подщелачивания мочи).

5.9.2 Сбор эякулята с предварительным подщелачиванием мочи

Подщелачивания мочи можно добиться, выпив воду с хлоридом натрия и бикарбонатом натрия за 1–2 часа до попытки сбора эякулята. Это можно сочетать со стимуляцией альфа-1-рецепторов.

В лаборатории мужчину следует попросить:

•собрать эякулят путем мастурбации в контейнер для образца; и

•помочиться после оргазма во второй контейнер (объемом не менее 500 мл).

5.9.3 Исследование образцов антеградного эякулята и мочи после оргазма

Необходимо исследовать как эякулят, если он есть, так и образцы мочи. Поскольку может быть получен большой объем мочи, часто бывает необходимо концентрировать образец путем центрифугирования (при 500g в течение 8 минут). Ретроградный образец после концентрации и антеградный образец, если он получен, могут быть наиболее эффективно подготовлены методом центрифугирования в градиенте плотности (раздел 5.5 на стр. 188).

5.10 Подготовка образцов, полученных в результате ассистированной эякуляции

Семенная жидкость у мужчин с нарушенной эякуляцией или анэякуляцией может быть собрана с помощью прямой вибростимуляции полового члена или ректальной электростимуляции добавочных половых желез. В эякуляте пациентов с повреждением спинного мозга часто наблюдаются высокая концентрация сперматозоидов, снижение подвижности сперматозоидов, а также загрязнение эритроцитами и лейкоцитами. Образцы, полученные путем электроэякуляции, наиболее эффективно обрабатываются путем ЦГП (раздел 5.5 на стр. 188). Независимо от метода подготовки, эти типы эякулята часто содержат высокую процентную долю неподвижных сперматозоидов.

193