Лабораторное руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека, шестое издание

ряда поставщиков. Необходимо следовать инструкциям к соответствующим наборам. Можно также составить наборы из отдельно закупленных ингредиентов.

2.Следует дождаться полного разжижения эякулята, а затем центрифугировать его при более 1000g в течение 15 минут. Затем можно удалить прозрачную семенную плазму. 10 мкл этой плазмы можно проверить, с тем чтобы убедиться в отсутствии сперматозоидов. Если сперматозоиды присутствуют, повторите центрифугирование.

3.Чистая семенная плазма может быть аликвотирована и непосредственно заморожена для последующего исследования. Это может быть полезным при проведении серии исследований. Стабильность результатов при любой заданной температуре замораживания должна быть проверена и подтверждена лабораторией, выполняющей исследование.

4.При подготовке к измерениям в рамках исследования все ингредиенты должны быть заранее доведены до комнатной температуры. Все используемые компоненты чувствительны к свету, поэтому во время подготовки и проведения исследования следует максимально уменьшить воздействие света, например выключить лабораторное освещение.

5.Измерения должны проводиться в двух препаратах (как абсолютный минимум). Абсорбция считывается при 750 нм.

4.1.4.2 Проблемы

•Опубликовано значительное количество убедительных данных о процедуре исследования и агентах, которые могут влиять на результаты в разных системах (287), но с точки зрения использования этого исследования для составления медицинского заключения о параметрах эякулята и влиянии АФК на фертильность его следует продолжать рассматривать как исследовательский тест до тех пор, пока не появятся убедительные данные, касающиеся репродуктивных исходов.

•Из-за различий между приборами и методологиями и низкой прогностической ценности данных научно обоснованных референсных значений не существует.

•В идеале результаты исследования следует считывать на микропланшетном ридере из-за большого количества дублирующих тестов и стандартов.

4.2 Оценка акросомной реакции

4.2.1Справочная информация

Для нормальной фертильности необходимы целостность структуры акросомы и способность к акросомальному экзоцитозу. Акросомная реакция – это процесс, который in vivo происходит в непосредственной близости от ооцита в преддверии проникновения сперматозоида через оболочку ооцита и слияния с

162

Глава 4. Углубленные исследования

ним. Считается, что инициирующим событием в нормальной акросомной реакции является приток кальция. В случаях тератозооспермии и олигозооспермии у некоторых пациентов, которые в остальном могут иметь нормальные результаты исследования эякулята, сперматозоиды могут демонстрировать изменения в структуре акросомы или в способности реагировать на стимулы акросомной реакции (288).

Известно несколько стимулов, вызывающих акросомную реакцию. В их число входят белки блестящей оболочки (289) и прогестерон (290), которые считаются возможными физиологическими индукторами акросомной реакции ввиду их повышенной концентрации вблизи ооцита. Акросомную реакцию вызывают и другие стимулы, такие как кальций-ионофоры, но полученные результаты не соотносятся или в меньшей степени соотносятся с результатами, полученными при акросомной реакции, индуцируемой блестящей оболочкой (291). Недавний мета-анализ (288) продемонстрировал значительную корреляцию процентной доли сперматозоидов, вступающих в индуцированную стимулами акросомную реакцию, с частотой оплодотворения. Акросомный статус после индукции акросомной реакции можно оценить с помощью микроскопии или проточной цитометрии (292) с использованием флуоресцентно меченных лектинов, таких как Pisum sativum (гороховый агглютинин) (раздел 4.4.1 на стр. 173) или Arachis hypogaea (арахисовый лектин), или моноклональных антител к акросомному антигену CD46 (293). Индукция притока кальция путем использования индукторов акросомной реакции является одним из способов проверки способности капацитированных сперматозоидов к акросомной реакции (294, 295). Вместе с тем, прежде чем исследование акросомного статуса можно будет считать рутинным клиническим исследованием, необходимо провести его дальнейшую валидацию и оценку.

Ниже описаны процедуры статической оценки акросомного статуса и динамической индуцированной акросомной реакции.

4.2.2 Оценка акросомного статуса

4.2.2.1 Процедура

ЭтотметодбылпервоначальноразработанКроссом(296)наосновеисследования Мортимера и др. (297), в котором было продемонстрировано, что агглютинин Arachis hypogea (арахиса) (FITC-PNA) связывается с наружной мембраной акросомы сперматозоида. Впоследствии метод был модифицирован Айткеном (294), который ввел реагент гипоосмотического набухания (раздел 2.5.13.2 на стр. 78) для оценки акросомной реакции только в живых сперматозоидах. Эта простая и воспроизводимая процедура позволяет получить очень четкие изображения (рис. 4.1 на стр. 166). Предпочтительно использовать препарат сперматозоидов с высокой подвижностью, свободный от таких загрязнений, как лейкоциты, половые клетки и мертвые сперматозоиды. Таким образом, в зависимости от качества образца и протокола исследования необходимо либо отмыть образец (раздел 5.3 на стр. 186), либо подготовить препараты с использованием метода всплытия (swim-up) или путем центрифугирования в градиенте плотности (раздел 5.4 на стр. 187 и раздел 5.5 на стр. 188).

163

Лабораторное руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека, шестое издание

4.2.2.2 Реагенты

•Агглютинин Pisum sativum (PSA), меченный изотиоцианатом флуоресцеина (FITC) (PSA-FITC);

•Агглютинин Arachis hypogaea (арахиса), меченный изотиоцианатом флуоресцеина (FITC) (AHLPNA-FITC);

•DPBS, pH 7,4;

•0,9%-ный (9 г/л) NaCl: растворить 0,9 г NaCl в 100 мл очищенной воды;

•95%-ный (v/v) этанол;

•Исходный раствор PSA и AHLPNA: разведите 2 мг PSA-FITC или AHLPNA-FITC в 4 мл DPBS и храните в аликвотах по 0,5 мл при – 20°C;

•Рабочий раствор PSA: разведите 0,5 мл исходного раствора PSA в 10 мл DPBS и храните при 4°C. Этот раствор остается стабильным в течение 4 недель.

4.2.2.3 Простое отмывание сперматозоидов

1.Тщательно перемешайте образец эякулята и отберите аликвоту объемом около 0,2 мл.

2.Разведите до 10 мл 0,9%-ным (9 г/л) солевым раствором.

3.Центрифугируйте при 800g в течение 10 минут.

4.Удалите супернатант, оставив 20–40 мкл.

5.Ресуспендируйте осадок сперматозоидов в оставленном супернатанте аккуратным пипетированием.

6.Повторите процедуру отмывания.

4.2.2.4 Обработка очищенных препаратов эякулята

1.Разведите препараты, подготовленные методом всплытия (раздел 5.4 на стр. 187) или однократно отмытые посредством центрифугирования в градиенте плотности (раздел 5.5 на стр. 188), до 10 мл буферным раствором для получения концентрации 10 млн/мл.

2.Центрифугируйте при 800g в течение 10 минут.

3.Удалите супернатант, оставив 20–40 мкл.

4.Ресуспендируйте осадок сперматозоидов в буферном растворе для гипоосмотического набухания в течение 30 минут.

5.Центрифугируйте при 800g в течение 10 минут.

164

Глава 4. Углубленные исследования

6.Удалите супернатант и ресуспендируйте в небольшом объеме буферного раствора аккуратным пипетированием.

4.2.2.5 Приготовление мазков

1.Сделайте несколько мазков длиной около 1 см из примерно 5 мкл суспензии сперматозоидов.

2.Изучите влажные мазки под фазово-контрастным микроскопом (×400).

3.Убедитесь, что сперматозоиды распределены на предметных стеклах равномерно и без наслоений.

4.Высушите на воздухе.

5.Фиксируйте в 95%-ном (v/v) этаноле в течение 30 минут.

6.Высушите на воздухе.

4.2.2.6 Окрашивание PSA-FITC

1.Налейте 10 мл рабочего раствора PSA-FITC или AHLPNA-FITC в вертикальный сосуд для окрашивания.

2.Погрузите зафиксированные и высушенные на воздухе предметные стекла в краситель PSA-FITC.

3.Оставьте окрашиваться более чем на 1 час при 4°C. Более длительное время окрашивания – до 18 часов – не влияет на результаты. Окрашивание в течение более короткого времени – менее 1 часа – затруднит оценку предметных стекол.

4.Промойте каждое предметное стекло очищенной водой и заключите их в водорастворимую среду (раздел 2.4.9.5 на стр. 56).

4.2.2.7 Оценка

Рассмотрите предметное стекло с помощью флуоресцентной оптики при увеличении ×1000 с масляной иммерсией при длине волны возбуждения 450– 490 нм и с комбинацией дихроичных фильтров, подходящей для наблюдения пиковой длины волны эмиссии в 519 нм.

Распределите сперматозоиды по следующим категориям:

•Живые с целой акросомой: сперматозоиды с закрученным хвостом, у которых более половины головки ярко и равномерно флуоресцирует (рис. 4.1); и

•Живые с прореагировавшей акросомой: сперматозоиды с закрученным хвостом, демонстрирующие только флуоресцирующую полоску в экваториальном сегменте или полное отсутствие флуоресцирующей окраски в акросомной области (рис. 4.1).

165

Лабораторное руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека, шестое издание

•Врамкахэтогоисследованиямертвыесперматозоидыобычнонеоцениваются, но мониторинг процентной доли мертвых клеток может позволить найти и устранить какие-либо ошибки в оценке/обработке полученных данных среди лиц, проходящих это исследование. Ожидается, что процентная доля мертвых клеток не будет значительно отличаться от их доли в исходном эякуляте.

Рис. 4.1 Примеры окрашенных FITC-PNA сперматозоидов с целой акросомой и прореагировавшей акросомой, жизнеспособных и нежизнеспособных сперматозоидов

Жизнеспособные сперматозоиды с целой

акросомой

Жизнеспособные сперматозоиды с прореагировавшей акросомой

У сперматозоидов с целой акросомой окрашена проксимальная часть головки (акросома), а у сперматозоидов с прореагировавшей акросомой окрашены полоски в экваториальном сегменте или постакросомная область. Закрученные хвосты указывают на жизнеспособность сперматозоидов после процедуры гипоосмотического набухания (см. также раздел 2.5.13.2 на стр. 78).

4.2.2.8 Подсчет сперматозоидов с прореагировавшей акросомой

1.Подсчитайте число сперматозоидов с каждой категорией акросом (с целой акросомой и с прореагировавшей акросомой) с помощью лабораторного счетчика.

2.Оцените 200 сперматозоидов в каждом препарате для получения приемлемо низкой ошибки выборки.

•Рассчитайтесреднеезначениеиразностьпроцентныхдолейсперматозоидов с прореагировавшей акросомой в двух препаратах.

•Определите приемлемость различия по таблице 2.3 на стр. 39, в которой приводятся максимальные различия между двумя подсчетами, которые, как ожидается, могут возникнуть в 95% образцов только из-за ошибки выборки.

•Если различие между процентными значениями приемлемо, укажите среднее процентное значение сперматозоидов с прореагировавшей акросомой. Если различие слишком велико, проведите повторную оценку двух предметных стекол.

166

Глава 4. Углубленные исследования

•Укажите процентную долю сперматозоидов с прореагировавшей акросомой с точностью до ближайшего целого числа.

4.2.3 Оценка индуцированной акросомной реакции

Акросомная реакция может быть вызвана путем использования ионофоров (Acrosome Reaction following Ionophore Challenge, ARIC) (298), прогестерона (Acrosome Reaction following Progesterone Challenge, ARPC) (290) или других стимулов.

4.2.3.1 Реагенты

•Дополненный сбалансированный солевой раствор Эрла (sEBSS – см. раздел 8.4 на стр. 263), содержащий 3,0%-ный (30 г/л) BSA.

Примечание. Если проводится индукция прогестероном, следует использовать делипидизированную/очищенную на активированном угле сыворотку, с тем чтобы избежать загрязнения другими жирорастворимыми молекулами (включая гормоны).

•Диметилсульфоксид (ДМСО).

•Исходный раствор ионофора A23187, 1 ммоль/л: растворите 5,23 мг A23187 в 10 мл ДМСО, прогестерон 2–10 мкг/мл (299) или другие индукторы акросомной реакции (288).

Примечание. Могут существовать законодательные требования в отношении мер предосторожности, поэтому перед использованием ионофора следует тщательно оценить риски.

•70%-ный (v/v) этанол.

4.2.3.2 Процедура

1.Оставьте свежий эякулят на 30–60 минут для полного разжижения.

2.Приготовьте среду sEBSS для индукции капацитации (среда должна быть свежей для каждого исследования).

3.Перед использованием нагрейте среду до 37°C, предпочтительно в аэрируемом инкубаторе с 5%-ной концентрацией (v/v) CO2.

4.Подготовьте популяцию сперматозоидов с высокой подвижностью, свободную от загрязнений, таких как лейкоциты, половые клетки и мертвые сперматозоиды, путем центрифугирования в градиенте плотности (ЦГП) (раздел 5.5 на стр. 188) или методом всплытия с использованием свежей среды sEBSS.

5.Подготовьте пробирки для контрольного образца и тестируемых препаратов, поместив в каждую из них примерно 1 мл суспензии с 1×106 подвижных сперматозоидов.

167