креиногенов образуются активные калликреины, катализирующие образование кининов, в первую очередь брадикинина, оказывающего стойкое и длительное влияние на проницаемость микрососудов и другие эффекты начального периода раневого процесса.

Вследствие дальнейшего повреждения тканей, нарушений кровообращения и развития тканевой гипоксии происходят накопление простагландинов, активация системы комплемента, появляются в свободном виде лизосомальные ферменты, количество которых резко увеличивается в связи с эмиграцией лейкоцитов и их гибелью в очаге воспаления.

Практически между всеми основными медиаторными системами имеется взаимная зависимость. Так, гистамин способствует образованию активного калликреина из калликреиногена, а его действие потенцируется простагландинами и ингибируется гепарином. Фактор Хагемана вызывает образование контактного калликреина и активного плазмина и в свою очередь активируется калликреином и плазмином. Брадикинин активирует фосфолипазу, которая приводит к образованию свободных жирных кислот и затем простагландинов. Комплемент С5а вызывает агрегацию лейкоцитов, в результате которой лейкоциты высвобождают ферменты и токсические продукты обмена. Лизосомальные ферменты активируют калликреиноген, фактор Хагемана, плазминоген и систему комплемента. С1-эстеразный ингибитор подавляет не только С1-ком- понент комплемента, но также калликреин, плазмин и фактор Хагемана и др.

Второй основной вывод заключается в том, что химические медиаторы в той или иной степени действуют на раневой процесс, на всех его этапах и на различные его проявления: микроциркуляцию, эмиграцию и хемотаксис лейкоцитов, фагоцитоз и регенерацию тканей.

С точки зрения управления механизмами раневого процесса представляет интерес изучение веществ, осуществляющих неспецифическую регуляцию

различных биохимических реакций на клеточном уровне. Их можно выделить как группу в н у т р и к л е т о ч н ы х м е д и а т о р о в . Из соединений этого типа наиболее широко изучаются циклические нуклеотиды: циклический аденозинмонофосфат (цАМФ), циклический гуанозинмонофосфат (цГМФ) и др.

По данным ряда авторов, эффекторные системы раневого процесса, такие как секреция гепарина и гистамина тучными клетками и базофилами, разрушение клеток-мишеней лимфоцитами, высвобождение ферментов из нейтрофильных лейкоцитов, агрегация тромбоцитов, хемотаксис и, вероятно, многие еще не изученные реакции, модулируются агентами, действующими на внутриклеточную концентрацию циклических нуклеотидов. Об этом мы неоднократно упоминали в данной главе.

Таким образом, цАМФ и вещества, повышающие его содержание (ингибиторы фосфодиэстеразы, р"-адренерги- ческие агенты, простагландин Е|) или активирующие фермент аденилатциклазу, которая находится в клеточной мембране и гидролизует АТФ до цАМФ и неорганического фосфата, тормозят названные выше эффекты. Напротив, производные цГМФ усиливают основные проявления воспаления. Значение циклических нуклеотидов состоит в том, что, взаимодействуя с другими мембранными компонентами, главным образом белками, они образуют аллостерическую рецепторную систему распознавания многих гормонов и биологически активных веществ, являясь посредниками между гуморальными влияниями и внутриклеточными реакциями.

3.3. ОБМЕН ВЕЩЕСТВ И ЭНЕРГИИ В РАНЕ

Давно известны значительные изменения обмена веществ в очаге повреждения, особенно такие, как ацидоз и увеличение осмотического давления в ткани. Еще Н. Schade (1921 — 1935)

карбоновых кислот наиболее устойчивы те, которые локализованы не только в митохондриальных мембранах, но и в гиалоплазме, а наименее устойчива сукцинатдегидрогеназа — единственный из изученных ферментов, не связанный с коферментом.

Образование грануляционной ткани, состоящей из сосудов и фибробластов, также сопровождается повышением активности ферментов, связанных с обменом энергии, причем накопление в клетках РНК и белка, а также синтез коллагена протекают на фоне выраженной стимуляции гликолиза и расщепления АТФ. Данные гистохимических исследований позволили установить, что в условиях воспаления синтез коллагеновых белков фибробластами сопряжен не только с окислительным, но и с гликолитическим фосфорилированием. На других моделях заживающих ран впоследствии это было подтверждено чисто биохимическими методами [Grant L., Prockop D., 1972].

Резкое повышение активности ферментов гликолиза в грануляционной ткани раны показано также J. Michael

исоавт. (1975). При определении активности фосфофруктокиназы, гексокиназы и лактатдегидрогеназы установлено, что на 4—8-е сутки заживления раны она увеличивается в 12,4

и5 раз. Особенно показательна активация фосфофруктокиназнои реакции, являющейся основной лимитирующей реакцией гликолиза. Активность ферментов цикла трикарбоновых кислот (фумаратгидратаза и изоцитратдегидрогеназа) увеличивалась в меньшей степени (максимально в 2—3 раза), а

малатдегидрогеназы — падала ниже нормы, начиная с 4-х суток. Важными являются сведения о пятикратном увеличении активности ферментов глутаматдегидрогеназы и Р-гидроксибути- рил-СоА-дегидрогеназы, осуществляющих связь углеводного обмена с белковым и жировым соответственно. Активность пентозного цикла повышается в 2'/г раза на 4-й день исследования.

Таким образом, в процессе разви-

тия грануляционной ткани в развивающихся микрососудах и фибробластах происходит активация цикла Кребса, гликолиза и пентозного цикла. Характерно, что повышение активности дегидрогеназы глюкозо-6-фосфа- та — фермента, принимающего участие в прямом окислении глюкозы, совпадает с увеличением концентрации РНК в цитоплазме и ядрышках фибробластов. Согласно биохимическим данным, в организме животных пентозный цикл является, вероятно, единственно возможным путем синтетического образования пентоз, входящих в состав различных соединений и в первую очередь нуклеиновых кислот. В отличие от лейкоцитов и макрофагов активация пентозного цикла в пролиферирующих фибробластах в основном связана с синтезом нуклеиновых кислот.

В дальнейшем при образовании большого количества микрососудов и улучшении оксигенации тканей происходят увеличение доставки кислорода, необходимого для синтеза коллагена и регенерации эпителия, и активация окислительного фосфорилирования. Однако гликолиз продолжается и на поздних стадиях, когда идет синтез и секреция коллагена.

3.3.2. ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНЫ (МУКОПОЛИСАХАРИДЫ)

Отличительной особенностью грануляционной ткани является интенсивное образование сложных полисахаридов — гликозаминогликанов. Прежнее и более привычное их название «мукополисахариды» является биохимически менее точным, но до сих пор часто употребляется. Новый термин «гликозаминогликаны» (правильнее гликозаминоглкжуроногликаны) и современная номенклатура этих соединений предложены в 1960 г. I. Jeanloz. Гликозаминогликаны представляют собой вещества, состоящие из аминосахаров (гликозамино-) и уроновых кислот (глюкуроно-), объединенных в длинные цепи (-гликаны). Другими

СХЕМА 3.6 Биосинтез гликоз аминогликанов

словами, гликозаминогликаны — полимеры дисахарида с повторяющимися блоками, содержащими аминосахар и уроновую кислоту.

Источником образования гликозаминогликанов в соединительной ткани являются в основном фибробласты, а также тучные и некоторые другие клетки. Биосинтез их начинается от молекулы глюкозы путем ее фосфорилирования и образования комплексов с уридиновыми нукле отидами (схема 3.6). Реакции катализируются ферментом гликозилтрансферазой. В результате образуются УДФ-глюкуроновая и УДФ-иду- роновая кислоты, УДФ-Ы-ацетилглюкозамин и УДФ-М-ацетилгалактозамин, которые полимеризуются в различные полисахариды.

Классификация и состав гликозаминогликанов представлены в табл. 3.2.

Как видно из табл. 3.2, аминогруппы гексозаминов во всех соединениях замещены N-ацетильными группами, хотя в гепарине и гепарансульфате они могут нести и N-суль- фатные группы. Гиалуроновая кислота и хондроитин являются несульфатированными гликозаминогликанами, так как не содержат сульфатных групп. Остальные вещества представляют собой сульфатированные соединения, среди которых гепарин выделяется тем, что содержит наибольшее количество сульфатных групп, т. е. является высокосульфатированным гликозаминогликаном. Полианионный характер этих макромолекул во многом обусловливает природу взаимодействия между гликозамино гликанами и другими молекулами и ионами межклеточного вещества соединительной ткани. Количество дисахаридных блоков, степень сульфатации и количество сульфатных групп

вгликозаминогликанах сильно меняются в зависимости от вида животного, типа ткани, патологических воздействий (от 20—100 блоков

вхондроитинсульфате до 100—20 000 в гиалуроновой кислоте).

Гликозаминогликаны существуют в тканях главным образом не в чистом виде, а в виде углеводной цепи, ковалентно связанной с белковым стержнем, в результате чего возникает макромолекула, обозначаемая термином «протеогликан». Ковалентные связи в отличие от водородных являются сильными, поскольку возникают вследствие обобществления электронов, когда связывающие электроны продолжают в той или иной степени оставаться в поле ядер, которым они первоначально принадлежали. Синтез белкового стержня необходим для инициирования гликозаминогликановой цепочки и предшествует ему [Lamberg S., Stoolmiller A., 1974]. Реакции катализируются ферментами — гликозилтрансферазами и сульфотрансферазами.

Реакция образования гликозаминогликана (в данном случае хондроитинсульфата) имеет следующий вид:

SO3

Первая реакция гликосилирования представляет собой перенос ксилозы, образованной из УДФ-глюкозы, к гидроксильной группе серинового остатка в белковой молекуле, к которой присоединяется синтезирующийся полисахарид. Следующая область химической связи определяется переносом двух молекул галактозы и глюкуроновой кислоты (2 и 3). Дальнейшее формирование хондроитиновой цепи происходит в результате чередующегося переноса N-ацетил- глюкозамина и глюкуроновой кислоты из их соединений с УДФ к концам растущей цепи. В процессе образования полисахарид модифицируется введением сульфатных групп путем эстерификации остатками серной кислоты (6).

Белковый стержень протеогликана синте-

клеточного вещества соединительной ткани, состоят из молекул коллагена. Одно коллагеновое волокно содержит миллионы отдельных плотно «упакованных» мономерных коллагеновых молекул, которые сейчас принято называть тропоколлагеном. Термин «коллаген» обычно употребляют для обозначения полимерного агрегата определенного количества тропоколлагеновых единиц в форме длинной полимерной цепи — фибриллы. Объединяясь, фибриллы образуют коллагеновые волокна.

Одна коллагеновая молекула состоит из трех спирально скрученных а-цепей (полипентидов). Каждая а-цепь в свою очередь состоит из примерно 1050 аминокислот и имеет длину 300 им. Триплетная молекула тропоколлагена имеет длину около 300 нм, ширину около 1,5 нм и молекулярную массу 270 000. Такая конфигурация обеспечивает стабильность молекулы и ее физические свойства.

Существуют 5 генетически различных типов коллагена и сочетания а цепей. Цепи различаются между собой неодинаковой последова-

эмбриональной ткани и ретикулиновых волокнах, IV типа (вместе с I) — в базальных мембранах и V типа — в базальных мембранах и некоторых органах. IV и V типы коллагена мало изучены. Важным является то обстоятельство, что фибробласты и другие клетки способны переключать синтез с одного типа коллагена на другой.

Кроме того, коллаген — не простой белок; он относится к категории гликопротеинов, поскольку содержит различные количества галактозы или галактозилглюкозы, ковалентно связанной О-галактозидными связями с определенными остатками гидроксилизина. Типы коллагена различаются также составом углеводного компонента. Например, в коллагене I и IV типов значительно больше гидроксилизина и углеводного компонента, чем в коллагене I и II типов.

Каждая а-цепь независимо от ее типа на всем протяжении построена таким образом, что каждая третья аминокислота в ней является остатком глицина. Это абсолютно необходимое условие образования коллагеновой спирали. Последующие аминокислоты в триплете (группе, состоящей из трех аминокислот и начинающейся с глицина) могут быть любые и обозначаются как X и Y, причем в третьей позиции всегда находится гидроксипролин или гидроксилизин. Схематически а-цепь может быть представлена следующим образом:

Гли Х-ГиПро-Гли X -ГиЛиз-Гли X -ГиПро Гли-

Установлено, что гидроксипролин (ГиПро) всегда находится в третьей позиции коллагенового триплета, что является пространственно необходимым условием, вытекающим из специфичности фермента, который осуществляет гидроксилирование остатка пролина.

Как уже говорилось, коллаген представля ет собой спирально скрученную молекулу. Спирали делятся на малые и большие. Малая спираль вызвана конформацией а-цепи; каждый виток повторяется через 0,9 мм, что соответствует длине трех остатков аминокислот, т. е. спиральным регионом цепи является один триплет. Каждая а-цепь обвивается вокруг двух других, в результате чего образуется большой завиток с повторяющейся дистанцией примерно в 10 нм (рис. 3.5). При денатурации молекула распадается на три цепи, имеющие неправильную конфигурацию.

Синтез коллагена и образование волокон осуществляется в несколько этапов:

1.Сборка а-цепей на рибосомах эндоплазматической сети фибробластов.

2.Образование протоколлагена.

3.Гидроксилирование и образование проколлагена.

4.Гликосилирование и образование тропоколлагена.

5.Секреция тропоколлагена из клетки.

6.Полимеризация в фибриллы.

7.Образование коллагенового волокна. После возникновения каждая а-цепь начина-

ет вытягиваться и объединяться с двумя другими цепями. При этом между цепями образуются водородные связи — водород прикрепляется к аминогруппе или гидроксильной группе, образуя связь с соседним кислородом ближайшей карбоксильной группы. Водородные связи являются слабыми, поэтому в дальнейшем молекула коллагена укрепляется более прочными связями. Одновременно в а-цепях происходят реакции гидроксилирования пролина и лизина, катализируемые соответствующими гидроксилазами (с участием аскорбиновой кислоты, Fe , молекулярного кислорода и а-кетоглю- тарата). За счет образования водородных связей гидроксипролин участвует в стабилизации коллагеновой спирали. Через гидроксильную группу гидроксилизина к коллагену присоединяется полисахарид, а в дальнейшем гидроксилизин принимает участие в образовании поперечной исчерченности.

Присоединение полисахарида (гликосилирование) происходит с участием фермента галактозилтрансферазы и ионов марганца, в результате чего образуется галактозогидроксилизиновая связь. После этого фермент гликозилтрансфераза катализирует образование 1,2-гликозид- ной связи глюкозы с галактозой, образуя дисахарид. В итоге образуется глюкозил-галактозил- гидроксилизин. Функциональное значение реакций гликосилирования не совсем ясно, но предполагается, что они необходимы для транспорта мономерного коллагена через клеточную мембрану.

Окончательной реакцией синтеза коллагена является превращение протоколлагена в колла-

ген (тропоколлаген). Этот процесс носит характер ограниченного нротеолиза и состоит в том, что под влиянием фермента проколла ген-пентидазы от молекулы нроколлагена от калывается примерно '/5 ее длины. В результате молекула меняет свои физико-химические свойства, становится в физиологических уело виях нерастворимой и проявляет тенденцию к выходу из клеток и образованию волокон.

Молекулы тропоколлагена, вышедшие из фибробластов в межклеточное вещество, агрегируются в волокна, причем располагаются по отношению друг к другу в соседних фибриллах зигзагообразно, со ступенями, кратными 68 им, что хорошо видно под электронным микроско пом. Сумма светлого и темного дисков составляет 68 нм. Одновременно образуются ковалентные (дегидроксилизинонорлейциновые) связи между цепями соседних молекул, представляющие собой наиболее прочный тип поперечных связей в коллагене и важный фактор стабилизации коллагенового волокна. Схема синтеза коллагена представлена на рис. 3.6.

Как уже упоминалось неоднократно, синтез коллагена и образование коллагеновых волокон сопровождаются образованием поперечных химических связей как внутри одной молекулы (интрамолекулярные связи), так и между соседними молекулами (интермолекулярные связи). От количества и характера этих связей зависит прочность коллагеновых волокон и соответственно прочность зажива ющей раны. На первом этапе образования тро поколлагена образующие его а-цепи держатся вместе только водородными связями, которые образуются также и между соседними молекулами тропоколлагена и участвуют в поддержании стабильности коллагеновой фибриллы. Од нако поскольку водородные связи являются слабыми связями, они легко разрываются даже при легких воздействиях, например, при растворении в холодной воде или нейтральном солевом растворе. Такой коллаген является непрочным и называется растворимым.

Постепенно его растворимость уменьшается в связи с образованием прочных ковалентных поперечных связей. Уже вскоре после синтеза тропоколлагеновой молекулы концевые участки остатка молекулы лизина, входящие в а цепь, расположенные близко к аминокислотным остаткам другой а-цепи, подвергаются окисли тельному дезаминированию (с участием фермента лизиламинооксидазы), в результате чего образуются 2 молекулы с альдегидными группами, подвергающиеся алдольной конденсации с образованием прочной интрамолекулярной связи (см. рис. 3.5). В результате молекула остается еще растворимой, но становится зна-

чительно более стабильной и устойчивой к действию гидролитических ферментов. При денатурации молекулы слабые водородные связи разрываются и в растворе появляются свободные а-цепи. Ковалентные же связи сохраняются, и те а-цепи, которые были ими соединены в тропоколлагене, остаются соединенными вместе и в растворе (см. рис. 3.6).

Растворимость коллагена значительно снижается, когда ковалентные связи образуются между а-цепями соседних молекул тропоколлагена. Чаще всего эти интермолекулярные связи об разуются между аминогруппой остатка лизина одной молекулы и карбоксильной группой гидроксилина соседней молекулы — гидроксилизинонорлейциновые связи. В том случае, если связи образованы двумя лизиновыми остатками, они называются лизинонорлейциновыми. Наконец, связи, образованные двумя гидроксилизиновыми остатками, носят название дигидроксилинонорлейциновые связи и являются самыми прочными. Кроме того, в коллагене обнаружены межмолекулярные связи и среди других аминокислот гистидиногидроксимеродесмозиновые, гидроксимеродесмозиновые и др.

Количество и процентное отношение поперечных связей в разных типах коллагена значительно различается. В коллагене рубца имеется больше дигидроксилизинонорлейциновых связей и относительно меньше гидроксилизинонорлейциновых и гистидиномеродесмозиновых по сравнению с нормальной дермой. По составу связей вновь образованный коллаген рубца наиболее похож на эмбриональный тин коллагена (тип III). Впоследствии он замещается типом I, причем в гипертрофических рубцах этой смены не происходит, и коллаген остается более грубым. Причина молекулярных нарушений в синтезе коллагена в гипертрофических рубцах неизвестна, но выяс нение ее представляет значительный практический интерес.

Окончательное формирование коллагеновых волокон завершается образованием комплексов с другими компонентами межклеточного вещества соединительной ткани — фибронектином, матриксными белками, обладающими высокой способностью к комплексообразованию. Полное завершение образования волокон происходит только через несколько недель после заживления раны.