4 курс / Дерматовенерология / ЭСТЕТИЧЕСКАЯ_МЕДИЦИНА_3_ОТ_2019_ГОДА

вой клетчатки (ПЖК). Все это обеспечивает препаратам Advance широкий перечень клинических показаний при работе в самых разных зонах коррекции (табл. 2).

Вклинической практике используют 4 основных протокола применения препаратов Advance:

Advance Hydro − для восстановления гидрорезерва и длительного увлажнения кожи;

Advance Lift − для создания мгновенного эффекта лифтинга;

Advance Tight − для уплотнения кожи и восстановления коллагеновой структуры дермы;

Advance Fill − для восполнения в ткани объемов, утраченных из-за дефицита ПЖК.

Взависимости от показаний и задач специалист при работе с пациентом может комбинировать разные протоколы. В рамках данного мастер-класса мы представим протокол Advance Hydro.

ПРОТОКОЛ ADVANCE HYDRO

При работе по данному протоколу используют препарат

Advance Medium.

1 этап. Разметка (рис. 2).

Зона коррекции: средняя и нижняя трети лица. Расстояние между точками ввода препарата − 1 см.

2 этап. Введение препарата (рис. 3).

Расходные материалы: препарат Advance Medium 1 мл,

иглы 29 G х 5 mm.

Техника введения: препарат вводят в микрокапельной технике. Глубина введения – 5 мм. Расход препарата на

Рис. 3. Инъекцию препарата Advance Medium выполняют под углом 90 градусов к поверхности кожи

1 инъекцию – 0,01 мл. Ввод осуществляют под углом 90 градусов.

Advance Medium вводят строго субдермально (препарат не должен визуализироваться).

3 этап. Легкий массаж в зоне коррекции (рис. 4).

МАСТЕР-КЛАСС КОСМЕТОЛОГИЯ

КОСМЕТОЛОГИЯ

Астаксантин в коррекции возрастных

морфологических изменений кожи

Резюме

Оксидативный стресс ускоряет старение кожи, а прием пищевых добавок, содержащих антиоксиданты, может его замедлить и уменьшить выраженность его признаков. Морфологический анализ остаточных компонентов поверхности кожи (ОКПК) позволяет выявить возрастную десквамацию корнеоцитов, наличие микроорганизмов и размеры липидных капель. Мы предположили, что прием антиоксиданта из группы каротиноидов астаксантина (4 мг/день в течение 4 недель) может влиять на морфологию кожи, и исследовали образцы ОКПК, полученные у пожилых добровольцев до и после приема пищевой добавки. В исследовании участвовал 31 доброволец (17 мужчин и 14 женщин) старше 40 лет. Образцы ОКПК брали с поверхности кожи лица в начале (день 0) и конце (день 29) исследования. Кроме того, в дни 0, 15 и 29 для оценки выраженности системного окисидативного стресса брали образцы крови и определяли в плазме крови содержание малонового диальдегида. Результаты показали снижение содержания малонового диальдегида в плазме крови во время приема астаксантина (на 11,2% в день 15 и на 21,7% в день 29). Анализ образцов ОКПК в конце

Н.Чалык a, b, В. Клочков a,b, Т. Бандалетова c,

Н.Кайл a, И. Петяев a

a Lycotec Ltd., Кембридж, Великобритания

b Саратовский медицинский университет, НИИ кардиологии, Саратов, Россия

c DiagNodus Ltd., Кембридж, Великобритания

Стаья печатается с любезного разрешения компании «Маруга»

периода исследования показал статистически значимое снижение интенсивности десквамации корнеоцитов (P=0,0075) и бактериальное присутствие (P=0,0367). Это, а также статистически значимое (P=0,0214) увеличение размеров липидных капель были более выражены у участников с ожирением (ИМТ > 30 кг/м2). Все наблюдаемые в ОКПК изменения показали, что кожа участников исследования приобрела особенности, присущие более молодой коже. Результаты показали, что постоянный прием астаксантина оказывает эффективное антиоксидантное и омолаживающее действие, особенно выраженное у пациентов с ожирением.

Ключевые слова: астаксантин, антиоксиданты, омолаживающее действие, поверхность кожи, десквамация корнеоцитов, малоновый диальдегид.

1 ВВЕДЕНИЕ

Каротиноиды – большая группа природных пигментов, в высоких концентрациях содержащихся в растениях, морских водорослях и микроорганизмах

[1–3]. Хорошо известно, что эти вещества обладают антиоксидантными и противовоспалительными свойствами [1–3]. Неоднократно подтверждено, что каротиноиды, поступающие в организм с пищей, уменьшают повреждающее влияние оксидативного стресса, реактивных форм азота и хронического воспаления, оказывая таким образом защитное и омолаживающее действие [1–6].

Астаксантин (3,3′-дигидрокси-бета, бета- каротин-4,4′-дион) – каротиноид из группы ксантофиллов, синтезируемый морскими водоросля-

ми, бактериями и грибами [7, 8]. Содержится в таких морепродуктах, как лосось, форель, краб, омар и креветки [7, 8]. Присутствует в них преимущественно в виде моноили диэфиров, которые гидролизуются в тонком кишечнике, что облегчает их всасывание [9]. Известны мощное антиоксидантное действие астаксантина, его способность «захватывать» свободные радикалы и другие окислители, и отсутствие у него прооксидантных свойств, присущих некоторым другим каротиноидам [10, 11]. Благодаря этим особенностям он эффективно защищает липидный слой клеточных мембран от перекисного окисления [7, 8, 12]. Кроме того, астаксантин оказывает иммуностимулирующее действие [13, 14], обладает противовоспалительными свойствами, блокируя развитие воспалительных реакций [15, 16]. Учитывая многочисленные доказательства его благоприятного воздействия на организм, FDA в 1999 году одобрила применение астаксантина в качестве нутрицевтика [17]. Наибольшее его количество содержится в зеленой морской водоросли Haematococcus pluvialis, которая в настоящее время служит главным природным источником этого каротиноида при производстве лечебно-профилактических пищевых добавок [17, 18].

Основной мишенью антиоксидантного действия астаксантина можно считать кожу [19, 20]. Это важно, поскольку в настоящее время ведутся активные исследования в области разработки новых препаратов, позволяющих предотвратить или даже полностью остановить процесс старения кожи. Сегодня старение кожи и ее возрастные изменения признаны глобальной проблемой [21], связанной с быстро увеличивающейся продолжительностью жизни во всем мире [22].

Кожа, особенно эпидермис, служит своего рода барьером, защищающим организм от влияния окружающей среды. За ее барьерные функции отвечает поверхностный слой эпидермиса – роговой слой (РС) [23]. РС состоит из почти 20 слоев дифференцированных корнеоцитов, заключенных в богатый липидами межклеточный матрикс [23]. Роговой слой кожи лица более тонкий и состоит всего из 7–11 слоев корнеоцитов [24]. Поверхность РС покрыта тонкой водно-жировой пленкой, называемой «кислотной мантией» (из-за присущего ей низкого pH). Установлено, что «кислотная мантия» представляет собой сочетание липидов, вырабатываемых сальными железами и клетками эпидермиса, отшелушенных корнеоцитов и пота. Поэтому было предложено называть этот комплекс «остаточными компонентами поверхности кожи» (ОКПК, в англий-

ской транскрипции RSSC – residual skin surface components) [25].

После 30 лет начинают развиваться возрастные изменения кожи [26], включая постепенное ухудшение барьерной функции эпидермиса [27, 28], снижение эластичности кожи, уменьшение ее увлажненности, атрофию, атонию и формирование морщин. Считается, что эти изменения вызваны двумя основными причинами – внутренним биологическим старением и внешним фотостарением, проявления которого особенно выражены на коже лица [21, 29].

Неоднократно показано, что пищевые добавки, содержащие каротиноиды, в частности астаксантин, оказывают на кожу омолаживающее действие, восстанавливая ее увлажненность и эластичность, целостность ее эпидермального барьера, сокращая морщины [19, 30–32]. Однако выявить механизмы, обуславливающие такие эффекты, в ходе исследований с участием пациентов технически сложно, поскольку сопряжено с инвазивными методами взятия образцов кожи лица. Мы решили эту проблему, разработав простой неинвазивный метод получения образов ОКПК с поверхности кожи лица [33], который позволяет определить возрастные морфологические изменения кожи и у мужчин [33], и у женщин [34].

Предполагая, что постоянное употребление астаксантина приводит к уменьшению системного окислительного стресса, мы выдвинули гипотезу о том, что это может уменьшить возрастные изменения в РС, что отразится и на ОКПК. Для проверки этой гипотезы мы выполнили сравнительную морфологическую оценку ОКПК у пациентов средних лет до и после приема астаксантина в течение 4 недель. Кроме того, мы выполнили оценку системного действия пищевой добавки с астаксантином, для чего определяли содержание в плазме крови всех участников исследования малонового диальдегида (МДА) – маркера системного окислительного стресса [35, 36].

2МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1Схема исследования

Совместное исследование было осуществлено компанией Lycotec Ltd., (Кембридж, Великобритания) и НИИ кардиологии МЗ РФ (Саратов, Россия). Пациентов для исследования выбирали в Саратове из числа здоровых добровольцев. Протокол иссле-

КОСМЕТОЛОГИЯ

КОСМЕТОЛОГИЯ

(по 4 стекла для каждого участника) указывали кодовое обозначение для обеспечения анонимности при проведении слепого исследования. Все собранные образцы отправляли в лабораторию Lycotec Ltd. для дальнейшей обработки и микроскопии.

2.3Определение МДА в образцах плазмы

Для оценки интенсивности окислительного стресса определяли концентрацию МДА в образцах плазмы крови. Использовали набор для определения реактивных соединений тиобарбитуровой кислоты (Cayman Chemical, Мичиган, США). Анализ выполняли согласно описанию [37] и инструкциям к набору. Концентрацию МДА оценивали с помощью микропланшетного фотометра Multiskan FC (Thermo Fisher Scientific Oy, Вантаа, Финляндия) по изменению оптической плотности при длине волны 532 нм. Серию стандартных разведений для калибровки готовили с использованием стандарта МДА, поставляемого в наборе.

Первичная обработка результатов включала построение калибровочной кривой и преобразование значений поглощающей способности изучаемой концентрации МДА. Вычисления проводили с помощью программного обеспечения Skanit Software для Multiscan FC (AmsterChem, Амстердам, Нидерланды).

2.4Морфологический анализ образцов RSSC

При морфологическом анализе образцов ОКПК один микропрепарат из первой пары окрашивали гематоксилином и эозином, чтобы идентифицировать любые клетки или клеточные фрагменты. Второй микропрепарат окрашивали суданом красным (набор для окрашивания липидов Lipid Stain, ab150678; Abcam, Кембридж, Великобритания) для визуализации липидов и оценки размеров жировых капель. Один микропрепарат из второй пары окрашивали метиловым фиолетовым (окраска по Граму) для оценки наличия микроорганизмов. Оставшиеся микропрепараты сохраняли неокрашенными для возможного будущего использования.

Все окрашенные препараты исследовал опытный цитолог. Микроскопию выполняли с помощью лабораторного микроскопа Olympus BX41 (Olympus, Токио, Япония) при увеличении ×1000. Анализ включал исследование одного препарата в 40 полях зрения. Для визуализации липидных

кристаллов применяли темнопольную микроскопию. Микрофотографии делали с помощью камеры Olympus DP71.

Анализ типичных структурных элементов ОКПК включал измерение размеров жировых капель, подсчет характерных кристаллов липидов, слущенных корнеоцитов и количества бактерий, как описано ранее [33, 34]. Размер круглых жировых капель оценивали по их диаметру, овальных – по длине продольной оси. Размеры определяли с помощью программного обеспечения для обработки изображений Cell^B (Digital Imaging Solutions, Olympus, Япония). Результаты измерений суммировали и выражали в виде среднего размера капель у каждого пациента на момент времени. Аналогично у каждого участника на момент времени определяли количество кристаллов липидов и слущенных корнеоцитов (в среднем в поле зрения микроскопа). Количество бактерий в поле зрения оценивали по предложенной нами 5-балльной шкале оценки бактериального присутствия (1 – минимальное количество бактерий в поле зрения, 5 – обилие бактерий в поле зрения). Эта шкала подробно описана в нашей статье [33]. Все образцы, используемые для микроскопии, были анонимны, что гарантировало проведение слепого исследования.

Таким образом, характеристики ОКПК, оцененные у каждого участника на момент времени, включали размер жировых капель, количество слущенных корнеоцитов и кристаллов липидов и наличие бактерий (по шкале оценки присутствия бактерий).

2.5 Статистический анализ

Обработку данных и статистический анализ результатов выполняли с использованием программы для статистической обработки данных IBM SPSS 19.0 (IBM Inc, Армонк, Нью-Йорк, США). Количественные результаты вычисляли для всей исследуемой популяции, а также отдельно для мужчин и женщин. Для подгрупп участников, сформированных в зависимости от их ИМТ (нормальный вес, избыточный вес, ожирение), выполняли отдельный анализ.

Сравнивали результаты всех количественных измерений (или вычислений), полученные в контрольные моменты времени. При анализе МДА сравнение выполняли в дни 0, 15 и 29; результаты исследования ОКПК сравнивали только в начальный и заключительный дни исследования (дни 0 и 29). Использовали описательные статистические данные. Определяли средние значения, стандартные отклонения, стандартные ошибки среднего (СОС),

КОСМЕТОЛОГИЯ

КОСМЕТОЛОГИЯ

ТАБЛ. 1. Изменение концентрации МДА при употреблении астаксантина в течение всего периода исследования в подгруппах участников с различной комплекцией (на основе ИМТ)

Значения представлены как среднее ± СОС.

Буквы верхнего индекса (a-c; d; e-f; h-j) указывают на статистически значимую разницу (p < 0,05) в концентрации МДА в разные моменты времени при вычислении с использованием парного t-теста.

между подгруппами не было статистически значимым, что неудивительно, учитывая небольшое количество участников с нормальным весом.

МДА мкмоль/л

Рис. 2. Содержание МДА в плазме крови в 3 момента времени в ходе исследования (среднее ± СОС)

3.3Анализ ОКПК: размер липидных капель

Липидные капли, присутствующие в полученных образцах ОКПК, легко визуализировались при окраске суданом красным (рис. 3), что позволяло их измерить при микроскопии с помощью программного обеспечения Cell^B.

Рис. 3. Микрофотография, показывающая присутствие липидных капель в образце RSSC (липидные капли показаны стрелками); окрашивание суданом красным, ув. х1000

Рис. 4. Диаграммы рассеяния, иллюстрирующие распределение персональных результатов участников (белые символы – женщины; серые символы – мужчины): размер липидных капель в виде средних значений (А); средние количества

слущенных корнеоцитов в поле зрения микроскопа (**p = 0,0075; сравнение с использованием t-критерия) (В); средние количества кристаллов липидов в поле зрения микроскопа (С); среднее присутствие микроорганизмов в поле зрения микроскопа по нашей шкале оценки

бактериального присутствия [24] (*p = 0,0367) (D)

ли употребления астаксантина (день 29), показала наличие явно выраженной тенденции (см. рис. 4B). В конце исследования интенсивность десквамации корнеоцитов у большинства волонтеров была заметно снижена, что было убедительно подтверждено парным t-тестом, (p = 0,0075). У некоторых участников разница в интенсивности десквамации легко определялась при микроскопическом анализе (рис. 5). Однако статистически значимое

Рис. 5. Микрофотографии слущенных корнеоцитов

вобразцах ОКПК, взятых у одного из участников

вначале исследования (A) и в день 29 (B); окраска гематоксилином и эозином, ув. х1000

(p = 0,0473) уменьшение десквамации корнеоцитов наблюдалось только у участников с ожирением. Различий, связанных с полом, не отмечали.

3.5Анализ ОКПК: кристаллы липидов

Хотя кристаллические структуры были определены

вобразцах ОКПК большинства участников, какойлибо выраженной тенденции, связанной с приемом астаксантина, выявить не удалось.

Распределение количества кристаллов липидов

вначале и конце исследования представлено на рисунке 4C. Оно не зависело ни от ИМТ, ни от пола участников.

3.6Анализ ОКПК:

наличие микроорганизмов

Анализ присутствия микроорганизмов в образцах ОКПК проводили с использованием нашей [33] полуколичественной шкалы. Полученные результаты представлены на рисунке 4D. В конце исследования у всех участников было выявлено статистически значимое (p = 0,0367) уменьшение их количества, в том числе среди участников с ожирением (p = 0,0312). Никаких различий, связанных с полом, не отмечено.

4 ОБСУЖДЕНИЕ

Прием пищевых добавок для омоложения и профилактики старения кожи – быстро развивающееся направление исследований, способное привести к разработке новых нутрицевтических средств [39]. Поскольку астаксантин считается одним из самых мощных антиоксидантов, обладающих омолаживающим действием на кожу [19, 30–32], нас особенно интересовало выявление этого действия в ОКПК, взятых неинвазивным способом с поверхности кожи лица. Наша предыдущая работа [33, 34] позволила сделать вывод о том, что образцы ОКПК, полученные у пожилых людей, характеризуются более выраженной десквамацией корнеоцитов, присутствием большого количества бактерий и наличием липидных капель меньшего размера.

В данной работе мы исследовали действие пищевой добавки, содержащей умеренную дозу астаксантина и, по данным литературы [40, 41], устойчиво

повышающей содержание МДА в плазме крови, и продемонстрировали выраженное действие этого каротиноида как на общий окислительный стресс, так и на морфологические характеристики ОКПК. Действительно, употребление астаксантина в течение 4 недель привело к постепенному заметному снижению концентрации МДА в плазме и, по-видимому, способствовало уменьшению десквамации корнеоцитов и сокращению присутствия микроорганизмов. Это можно интерпретировать как признаки замедления возрастных изменений кожи, поскольку, как было сказано ранее, интенсивная десквамация корнеоцитов и большое количество микроорганизмов в ОКПК характерны для кожи лица пожилых людей [33, 34].

Связь процессов старения с повышенным содержанием МДА в плазме крови доказана и неоднократно описана [42–44]. Кроме того, очевидно, что к снижению его содержания могут привести коррекция питания, включая прием антиоксидантов [45–47], и даже изменение образа жизни [48]. В то же время до сих пор относительно мало известно о возможном влиянии астаксантина на концентрацию МДА. Хотя некоторые эксперименты показали, что этот антиоксидант способствует ее снижению [49–51], до нас это было продемонстрировано на людях только группой корейских специалистов [52–54].

Роговой слой кожи – одна из многочисленных мишеней действия МДА, особенно «в контексте» фотоокислительного стресса [55], способствующего фотостарению, гиперпролиферации кератиноцитов и их интенсивной десквамации [33, 34, 56]. Предполагается, что окислительное повреждение белка способствует его денатурации [29], облегчая таким образом десквамацию дифференцированных корнеоцитов. Это предположение подтверждено повышенным содержанием МДА у пациентов с псориазом – кожным заболеванием, которое характеризуется избыточной пролиферацией и отшелушиванием кератиноцитов и воспалительными реакциями кожи [57]. Результат нашего исследования показал, что постоянный прием астаксантина в течение всего лишь 4 недель приводит к выраженному снижению содержания МДА в плазме крови. Очевидно, это указывает на общее антиоксидантное действие астаксантина. По-видимому, одновременно уменьшается окислительное повреждение кожи, что и приводит к снижению отшелушивания кератиноцитов. Молекулярные механизмы последнего явления не совсем ясны, однако эксперименты доказали, что астаксантин способен накапливаться в коже [58, 59]. Недавно Komatsu с соавт. [59] показали, что астаксантин подавляет экспрессию

ингибитора протеазы в роговом слое кожи мышей, стимулируя таким образом протеолиз филаггрина, который способствует выработке натурального увлажняющего фактора, предотвращающего отшелушивание корнеоцитов (см. обзор молекулярных аспектов десквамации [60]). Для доказательства существования этого механизма в организме человека необходимы дальнейшие исследования.

В предыдущей работе мы показали, что присутствие бактерий на поверхности кожи лица у пожилых пациентов выше, чем у молодых [33]. Вероятно, это связано с возрастным нарушением функции иммунной системы [61], что приводит к незначительному воспалению и создает тем самым благоприятные условия для роста микроорганизмов. Сокращение бактериального присутствия после приема астаксантина согласуется с иммуностимулирующим [13, 14] и противовоспалительным [15, 16] действием этого каротиноида.

Следует признать, что у нашего исследования были ограничения. Не было контрольной группы (плацебо), но лонгитюдный («до/после») характер исследования давал гарантию, что начальный (до применения пищевой добавки) момент времени служил внутренним контролем для измерений, выполненных у каждого участника после окончания периода приема биодобавки. Кроме того, небольшое число волонтеров не позволило нам выполнить соответствующее сравнение показателей между подгруппами участников с разными ИМТ. Тем не менее полученные результаты позволяют предположить, что действие астаксантина может быть более выраженно у лиц с ожирением. Именно в этой подгруппе мы наблюдали не только статистически значимое снижение содержания в плазме МДА, десквамации корнеоцитов и количества микроорганизмов, но и увеличение размеров липидных капель, что также соответствует ранее определенным особенностям молодой кожи [33, 34]. Возможно, последнее наблюдение не так легко интерпретировать, но известно, что с возрастом содержание липидов на поверхности эпидермиса уменьшается [62, 63], причем одновременно снижается количество липофильных антиоксидантов, обычно присутствующих в себуме [62]. Тенденция к увеличению размеров липидных капель, наблюдаемая у участников с ожирением, может отражать антиоксидантное действие каротиноида, защищающего липиды себума от перекисного окисления. Можно предположить, что повреждение липидов и перекрестные связи, образующиеся при перекисном окислении, приводят к повышению вязкости себума. Наблюдаемое увеличение размеров липидных капель, может быть,

КОСМЕТОЛОГИЯ

КОСМЕТОЛОГИЯ

связано со снижением вязкости себума и может считаться признаком замедления возрастных изменений кожи, вызванным действием астаксантина.

Хотя из-за небольшого числа участников в подгруппах «нормального» и «избыточного» веса необходимо очень осторожно делать выводы, следует отметить, что корреляция между высоким ИМТ, силой окислительного стресса и высоким содержанием МДА была ранее обнаружена другими исследователями у женщин в период постменопаузы [64, 65]. Логично предположить, что у пациентов с ожирением и высоким уровнем окислительного стресса будет наблюдаться более выраженный ответ на антиоксидантное действие астаксантина, однако без обширных подтверждающих исследований окончательный вывод о более явном омолаживающем эффекте астаксантина у пациентов с ожирением может оказаться преждевременным.

В предыдущих исследованиях мы наблюдали изменения в ОКПК, касающиеся наличия там липидных кристаллов и зависимости их размеров и количества от возраста [33, 34], но в данной работе никакого выраженного действия астаксантина на эти структуры (которые, вероятно, связаны с кожным салом [66]), обнаружено не было.

5 ВЫВОДЫ

Таким образом, мы успешно подтвердили нашу гипотезу, показав, что постоянное употребление астаксантина в течение всего лишь в течение 4 недель привело к изменениям в ОКПК, согласующимся с замедлением процесса старения. Результаты также демонстрируют, что морфологическое исследование ОКПК – полезный инструмент оценки эффективности пищевых добавок, предназначенных для улучшения состояния кожи. Хотя мы убеждены, что полученные результаты могут способствовать созданию новых подходов к предупреждению старения кожи, для лучшего понимания описанных явлений необходимы обширные исследования.

ЛИТЕРАТУРА

1.McNulty H, Jacob RF, Mason RP. Biologic activity of carotenoids related to distinct membrane physicochemical interactions. Am J Cardiol, 2008;101:20D–9D [suppl].

2.Rao AV, Rao LG. Carotenoids and human health. Pharmacol Res, 2007;55:207–16.

3.Kaulmann A, Bohn T. Carotenoids, inflammation, and oxidative stress—implications of cellular signalling pathways and relation to chronic disease prevention. Nutr Res 2014;34:907–29.

4.Woodside JV, McGrath AJ, Lyner N, et al. Carotenoids and health in older people. Maturitas, 2015;80:63–8.

5.Wolak T, Paran E. Can carotenoids attenuate vascular aging? Vascul Pharmacol, 2013;59:63–6.

6.Raposo MF, de Morais AM, de Morais RM. Carotenoids from marine microalgae: a valuable natural source for the prevention of chronic diseases. Mar Drugs, 2015;13:5128–55.

7.Kidd P. Astaxanthin, cell membrane nutrient with diverse clinical benefits and anti-aging potential. Altern Med Rev, 2011;16:355–64.

8.Yuan J-P, Peng J, Yin K, et al. Potential health-promoting effects of astaxanthin: a high value carotenoid mostly from microalgae. Mol Nutr Food Res, 2011;55:150–65.

9.Sugawara T, Yamashita K, Asai A, et al. Esterification of xanthophylls by human intestinal Caco-2 cells. Arch Biochem Biophys, 2009;483:205–12.

10.Martin HD, Ruck C, Schmidt M, et al. Chemistry of carotenoid oxidation and free radical reactions. Pure Appl Chem, 1999;71:2253–62.

11.Beutner S, Bloedorn B, Frixel S, et al. Quantitative assessment of antioxidant properties of natural colorants and phytochemicals: carotenoids, flavonoids, phenols and indigoids. The role of -carotene in antioxidant functions. J Sci Food Agric, 2001;81:559–68.

12.Gammone MA, Riccioni G, D›Orazio N. Marine carotenoids against oxidative stress: effects on human health. Mar Drugs, 2015;13:6226–46.

13.Speranza L, Pesce M, Patruno A, et al. Astaxanthin treatment reduced oxidative induced pro-inflammatory cytokines secretion in U937: SHP-1 as a novel biological target. Mar Drugs, 2012;10:890–9.

14.Lin KH, Lin KC, Lu WJ, et al. Astaxanthin, a carotenoid, stimulates immune responses by enhancing IFN-

and IL-2 secretion in primary cultured lymphocytes in vitro and ex vivo. Int J Mol, Sci 2015;17. https:// doi. org/10.3390/ijms17010044 [pii:E44].

15.Yasui Y, Hosokawa M, Mikami N, et al. Dietary astaxanthin inhibits colitis and colitis-associated colon carcinogenesis in mice via modulation of the inflammatory cytokines. Chem Biol Interact, 2011;193:79–87.

16.Miyachi M, Matsuno T, Asano K, et al. Anti-inflammatory effects of astaxanthin in the human gingival keratinocyte line NDUSD-1. J Clin Biochem Nutr, 2015;56:171–8.

17.Lorenz RT, Cysewski GR. Commercial potential for Haematococcus microalgae as a natural source of astaxanthin. Trends Biotechnol, 2000;18:160–7.