4 курс / Дерматовенерология / Клиническая_дерматология_и_венерология_2019_1
.pdf
Лабораторная диагностика |
Laboratory diagnosis |
Mardanly S.G. — http://orcid.org/0000-0002-4556-135X
Avdonina A.S. — https://orcid.org/0000-0002-2990-4930
Rotanov S.V. — http://orcid.org/0000-0002-3222-1401
Ivanova M.Yu. — http://orcid.org/0000-0002-7696-9809
Pomazanov V.V. — http://orcid.org/0000-0002-7336-99
TO CITE THIS ARTICLE:
Mardanly SG, Avdonina AS, Rotanov SV, Ivanova MYu, Pomazanov VV. The experience of using a domestic test system for linear immunoblotting in the laboratory diagnosis of syphilis. Russian Journal of Clinical Dermatology and Venereology = Klinicheskaya dermatologiya i venerologiya. 2020;19(1):18-23. (In Russ.) https://doi.org/10.17116/klinderma20201901118
Несмотря на очевидную тенденцию к снижению заболеваемости сифилисом в РФ, медикосоциальная значимость этой инфекции остается очень высокой, а эффективность и своевременность ее диагностики отнюдь не утратили своей актуальности [1]. По-прежнему актуальна проблема эффективности лабораторных исследований в диагностике сифилиса, в особенности его ранних и скрытых форм.
Впрактике лабораторных исследований на сифилис особая роль отведена подтверждающим тестам,
вчастности иммунному блоттингу (ИБ), позволяющему выявлять в исследуемом образце антитела к отдельным антигенам Treponema pallidum.
По мнению Т.И. Долгих, ИБ целесообразно применять в следующих случаях:
1)с целью подтверждения положительных результатов выявления антител класса G и М при иммуноферментном анализе (ИФА), особенно у беременных и пациентов, страдающих аутоиммунными заболеваниями, поскольку у этих групп лиц возможно получение ложноположительного результата ИФА, обусловленного перекрестным реагированием антител, а также у пациентов, анамнестические и клинические данные которых позволяют сомневаться в наличии сифилиса;
2)с целью установления диагноза «врожденный сифилис» (обнаружение IgM к отдельным антигенам или ко всему спектру специфичных антигенов Treponema pallidum с молекулярными массами 15, 17, 41—45 и 47 кДа дает основание для постановки такого диагноза);
3)с целью мониторинга течения сифилитической инфекции на разных стадиях лечения, а также с целью оценки эффективности проводимой терапии;
4)во время диспансерного наблюдения пациентов, перенесших сифилис (особенно при серологической резистентности и аутоиммунном процессе);
5)с целью исключения/подтверждения повторного заражения [2].
Особую значимость ИБ приобретает для уточнения диагноза в тех случаях, когда при предварительном обследовании различные серологические реакции дают противоречивые результаты.
В2010 г. была зарегистрирована Росздравнадзором и внедрена в практику для использования в ка-
честве подтверждающего теста при лабораторной диагностике сифилиса тест-система для ИБ в формате Line-blot («Лайн-Блот Сифилис» производства ЗАО «ЭКОлаб»), включающая комплекты для выявления антител классов М и G [3, 4]. За прошедшие годы накоплен определенный опыт использования этой системы, в том числе при обследовании пациентов, результаты предварительного тестирования которых не позволяли сделать какое-либо определенное заключение об их состоянии.
Цель исследования
При обследовании пациентов с подозрением на сифилис в последние 10 лет был получен ряд сывороток, в предварительных исследованиях которых с использованием реакций микропреципитации (РМП) и пассивной гемагглютинации (РПГА), а также скрининговых иммуноферментных тест-систем (ИФТС) различных производителей получены противоречивые результаты, не позволяющие однозначно диагностировать состояние обследуемых. В связи с этим возникла необходимость дополнительного тестирования указанных образцов на наличие IgM и IgG к отдельным антигенам T.pallidum в обоих комплектах тест-системы «Лайн-Блот Сифилис». Целью настоящего исследования стало обобщение полученных при этом результатов.
Материал и методы
Исследовано 54 сыворотки, полученные из ЛПУ Московской области и предварительно охарактеризованные в РМП (с использованием набора реагентов «АгКЛ-РМП» ЗАО «ЭКОлаб»), РПГА («Сифилис-РПГА-тест» ЗАО «ЭКОлаб») и иммуноферментном анализе (ИФА) (с использованием скрининговых ИФТС производства ЗАО «ЭКОлаб», ЗАО «ВекторБест» и ООО «НПО “Диагностические системы”».
Линейный иммуноблоттинг (ЛИБ) выполнен с использованием тест-системы «Лайн-Блот Сифилис» (ЗАО «ЭКОлаб»; комплекты для выявления антител классов М и G в соответствии с требованиями инструкции по применению данной тест-системы).
Russian Journal of Clinical Dermatology and Venereology 2020, Vol. 19, No. 1 |
19 |
Лабораторная диагностика |
Laboratory diagnosis |
Таблица 1. Результаты исследования сывороток на наличие IgG к отдельным антигенам T.pallidum в ЛИБ
Table 1. The results of the study of sera for IgG to individual T.pallidum antigens in LIB
Номер |
Наличие IgG к антигенам |
Результат |
||||
образца |
15 |
17 |
41 |
47 |
||
|
||||||
1 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
2 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
3 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
4 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
5 |
— |
0,5+ |
— |
0,5+ |
Положительный |
|
6 |
— |
0,5+ |
0,5+ |
— |
Положительный |
|
7 |
0,5+ |
— |
— |
1+ |
Положительный |
|
8 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
9 |
0,5+ |
1+ |
1+ |
0,5+ |
Положительный |
|
10 |
3+ |
0,5+ |
— |
0,5+ |
Положительный |
|
11 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
12 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
13 |
0,5+ |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
14 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
15 |
0,5+ |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
16 |
0,5+ |
1+ |
0,5+ |
1+ |
Положительный |
|
17 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
18 |
0,5+ |
0,5+ |
— |
0,5+ |
Положительный |
|
19 |
1+ |
1+ |
0,5+ |
0,5+ |
Положительный |
|
20 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
21 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
22 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
23 |
0,5+ |
1+ |
0,5+ |
0,5+ |
Положительный |
|
24 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
25 |
— |
— |
— |
0,5+ |
Отрицательный |
|
26 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
27 |
1+ |
3+ |
— |
0,5+ |
Положительный |
|
28 |
— |
— |
— |
1+ |
Неопределенный |
|
29 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
Номер |
Наличие IgG к антигенам |
Результат |
||||
образца |
15 |
17 |
41 |
47 |
||
|
||||||
30 |
0,5+ |
1+ |
0,5+ |
0,5+ |
Положительный |
|
31 |
— |
0,5+ |
0,5+ |
— |
Положительный |
|
32 |
— |
0,5+ |
— |
— |
Отрицательный |
|
33 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
34 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
35 |
0,5+ |
1+ |
0,5+ |
0,5+ |
Положительный |
|
36 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
37 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
38 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
39 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
40 |
— |
— |
— |
3+ |
Неопределенный |
|
41 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
42 |
— |
0,5+ |
— |
— |
Отрицательный |
|
43 |
— |
— |
— |
0,5+ |
Отрицательный |
|
44 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
45 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
46 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
47 |
0,5+ |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
48 |
0,5+ |
3+ |
0,5+ |
0,5+ |
Положительный |
|
49 |
0,5+ |
3+ |
0,5+ |
0,5+ |
Положительный |
|
50 |
0,5+ |
— |
— |
0,5+ |
Положительный |
|
51 |
0,5+ |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
52 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
53 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
54 |
0,5+ |
— |
— |
0,5+ |
Положительный |
|
Примечание. «0,5+», «1+» и «3+» — результаты полуколичественного учета результатов в тест-системе «Лайн-Блот Сифилис», свидетельствующие о наличии антител к антигенам T.pallidum в исследуемом образце; «—» — результат, свидетельствующий об отсутствии антител к антигенам T.pallidum в исследуемом образце.
Результаты и обсуждение |
Далее были сопоставлены итоговые результаты |
|
исследования всех 54 образцов в обоих комплектах |
На первом этапе данной работы было проведено |
тест-системы «Лайн-Блот Сифилис» (табл. 3). |
исследование 54 спорных образцов на наличие IgG |
В итоге из 54 исследованных образцов 4 (7,4%) |
к отдельным антигенам T.pallidum в комплекте №1 |
остались неопределенными, причем в трех из них |
тест-системы «Лайн-Блот Сифилис» — «Лайн-Блот |
неопределенными были результаты оценки наличия |
Сифилис-IgG». Результаты данного исследования |
IgM при отрицательных результатах оценки наличия |
приведены в таблице 1. |
IgG, а в одном, наоборот, неопределенным был ре- |
Из 54 протестированных образцов 35 (65%) показали |
зультат оценки наличия IgG при отрицательном ре- |
отрицательный результат (отсутствие IgG к T.pallidum), |
зультате оценки наличия IgM. |
17 (31%) — положительный, 2 (4%) — неопределенный. |
По результатам ЛИБ 29 (53,7%) образцов ока- |
Далее было проведено исследование всех 54 об- |
зались отрицательными, т.е. в них не были обнару- |
разцов на наличие IgМ к отдельным антигенам T.pal- |
жены ни IgM, ни IgG, а 21 (38,9%) образец — поло- |
lidum в комплекте №2 тест-системы «Лайн-Блот Си- |
жительным, причем только в одном из них (образ- |
филис» — «Лайн-Блот Сифилис-IgМ» (табл. 2). |
це №6) были обнаружены и IgM, и IgG; в 4 образцах |
Из 54 проанализированных образцов 46 (85%) |
были выявлены IgM при отсутствии IgG, в 1 образ- |
показали отрицательный результат (отсутствие IgМ |
це IgM были выявлены при неопределенном резуль- |
к T.pallidum), 5 (9%) — положительный, 3 (6%) — не- |
тате оценки наличия IgG, в 16 образцах были выяв- |
определенный. |
лены только IgG. |
20 |
Клиническая дерматология и венерология 2020, Т. 19, № 1 |
Лабораторная диагностика |
Laboratory diagnosis |
Таблица 2. Результаты исследования сывороток на наличие IgМ к отдельным антигенам Treponema pallidum в ЛИБ
Table 2. The results of the study of sera for IgM to individual Treponema pallidum antigens in LIB
Номер |
Наличие IgM к антигенам |
Результат |
||||
образца |
15 |
17 |
41 |
47 |
||
|
||||||
1 |
0,5+ |
0,5+ |
0,5+ |
0,5+ |
Положительный |
|
2 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
3 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
4 |
0,5+ |
— |
0,5+ |
— |
Положительный |
|
5 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
6 |
0,5+ |
- |
0,5+ |
0,5+ |
Положительный |
|
7 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
8 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
9 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
10 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
11 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
12 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
13 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
14 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
15 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
16 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
17 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
18 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
19 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
20 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
21 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
22 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
23 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
24 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
25 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
26 |
— |
— |
1+ |
— |
Неопределенный |
|
27 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
|
|
|
|
|
|
|
Номер |
Наличие IgM к антигенам |
Результат |
||||
образца |
15 |
17 |
41 |
47 |
||
|
||||||
28 |
0,5+ |
0,5+ |
0,5+ |
0,5+ |
Положительный |
|
29 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
30 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
31 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
32 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
33 |
— |
— |
— |
1+ |
Неопределенный |
|
34 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
35 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
36 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
37 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
38 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
39 |
3+ |
— |
3+ |
3+ |
Положительный |
|
40 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
41 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
42 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
43 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
44 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
45 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
46 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
47 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
48 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
49 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
50 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
51 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
52 |
— |
— |
3+ |
— |
Неопределенный |
|
53 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
54 |
— |
— |
— |
— |
Отрицательный |
|
|
|
|
|
|
|
|
Таблица 3. Итоговые результаты исследования с помощью ЛИБ на наличие IgG и IgM к антигенам Treponema pallidum Table 3. The results of the study using the LIB for IgG and IgM to Treponema pallidum antigens
Номер образца |
Результат оценки наличия антител к T.pallidum |
Итоговый результат |
||
IgG |
IgM |
|||
|
|
|||
1 |
Отрицательный |
Положительный |
Положительный |
|
2 |
Отрицательный |
Отрицательный |
Отрицательный |
|
3 |
Отрицательный |
Отрицательный |
Отрицательный |
|
4 |
Отрицательный |
Положительный |
Положительный |
|
5 |
Положительный |
Отрицательный |
Положительный |
|
6 |
Положительный |
Положительный |
Положительный |
|
7 |
Положительный |
Отрицательный |
Положительный |
|
8 |
Отрицательный |
Отрицательный |
Отрицательный |
|
9 |
Положительный |
Отрицательный |
Положительный |
|
10 |
Положительный |
Отрицательный |
Положительный |
|
11 |
Отрицательный |
Отрицательный |
Отрицательный |
|
12 |
Отрицательный |
Отрицательный |
Отрицательный |
|
13 |
Отрицательный |
Отрицательный |
Отрицательный |
|
14 |
Отрицательный |
Отрицательный |
Отрицательный |
|
Продолжение таблицы см. на след. стр.
Russian Journal of Clinical Dermatology and Venereology 2020, Vol. 19, No. 1 |
21 |
Лабораторная диагностика Laboratory diagnosis
Таблица 3. Итоговые результаты исследования с помощью ЛИБ на наличие IgG и IgM к антигенам Treponema pallidum (окончание)
Table 3. The results of the study using the LIB for IgG and IgM to Treponema pallidum antigens
Номер образца |
Результат оценки наличия антител к T.pallidum |
Итоговый результат |
||
IgG |
IgM |
|||
|
|
|||
15 |
Отрицательный |
Отрицательный |
Отрицательный |
|
16 |
Положительный |
Отрицательный |
Положительный |
|
17 |
Отрицательный |
Отрицательный |
Отрицательный |
|
18 |
Положительный |
Отрицательный |
Положительный |
|
19 |
Положительный |
Отрицательный |
Положительный |
|
20 |
Отрицательный |
Отрицательный |
Отрицательный |
|
21 |
Отрицательный |
Отрицательный |
Отрицательный |
|
22 |
Отрицательный |
Отрицательный |
Отрицательный |
|
23 |
Положительный |
Отрицательный |
Положительный |
|
24 |
Отрицательный |
Отрицательный |
Отрицательный |
|
25 |
Отрицательный |
Отрицательный |
Отрицательный |
|
26 |
Отрицательный |
Неопределенный |
Неопределенный |
|
27 |
Положительный |
Отрицательный |
Положительный |
|
28 |
Неопределенный |
Положительный |
Положительный |
|
29 |
Отрицательный |
Отрицательный |
Отрицательный |
|
30 |
Положительный |
Отрицательный |
Положительный |
|
31 |
Положительный |
Отрицательный |
Положительный |
|
32 |
Отрицательный |
Отрицательный |
Отрицательный |
|
33 |
Отрицательный |
Неопределенный |
Неопределенный |
|
34 |
Отрицательный |
Отрицательный |
Отрицательный |
|
35 |
Положительный |
Отрицательный |
Положительный |
|
36 |
Отрицательный |
Отрицательный |
Отрицательный |
|
37 |
Отрицательный |
Отрицательный |
Отрицательный |
|
38 |
Отрицательный |
Отрицательный |
Отрицательный |
|
39 |
Отрицательный |
Положительный |
Положительный |
|
40 |
Неопределенный |
Отрицательный |
Неопределенный |
|
41 |
Отрицательный |
Отрицательный |
Отрицательный |
|
42 |
Отрицательный |
Отрицательный |
Отрицательный |
|
43 |
Отрицательный |
Отрицательный |
Отрицательный |
|
44 |
Отрицательный |
Отрицательный |
Отрицательный |
|
45 |
Отрицательный |
Отрицательный |
Отрицательный |
|
46 |
Отрицательный |
Отрицательный |
Отрицательный |
|
47 |
Отрицательный |
Отрицательный |
Отрицательный |
|
48 |
Положительный |
Отрицательный |
Положительный |
|
49 |
Положительный |
Отрицательный |
Положительный |
|
50 |
Положительный |
Отрицательный |
Положительный |
|
51 |
Отрицательный |
Отрицательный |
Отрицательный |
|
52 |
Отрицательный |
Неопределенный |
Неопределенный |
|
53 |
Отрицательный |
Отрицательный |
Отрицательный |
|
54 |
Положительный |
Отрицательный |
Положительный |
|
Заключение |
ленность результатов скрининговых исследований на |
|
наличие антител к T.pallidum в 50 случаях из 54, что |
Использование иммунного блоттинга в формаподтверждает высокую диагностическую эффектив-
те линейного блота позволило исключить неопреде- |
ность тест-системы «Лайн-Блот Сифилис». |
Участие авторов: |
Authors’ contributions: |
Концепция и дизайн исследования — С.Г. Марданлы |
The concept and design of the study — S.G. Mardanly |
Сбор и обработка материалов — С.В. Ротанов, М.Ю. |
Collecting and interpreting the data — S.V. Rotanov, M.Yu. |
Иванова, А.С. Авдонина |
Ivanova, A.S. Avdonina |
Написание текста — А.С. Авдонина |
Drafting the manuscript — A.S. Avdonina |
Редактирование — С.Г. Марданлы, В.В. Помазанов |
Revising the manuscript — S.G. Mardanly, V.V. Pomazanov |
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. |
The authors declare no conflict of interest. |
22 |
Клиническая дерматология и венерология 2020, Т. 19, № 1 |
Лабораторная диагностика |
Laboratory diagnosis |
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1.Потекаев Н.Н., Фриго Н.В., Алмазова А.А., Лебедева Г.А. Эпидемиология сифилиса в современных условиях. Клин дерматол венерол. 2015; 1:22-34.
Potekaev NN, Frigo NV, Almazova AA, Lebedeva GA. Syphilis epidemiology under modern conditions. Russian Journal of Clinical Dermatology and Venereology = Klinicheskaya dermatologiya i venerologiya. 2015;1:22-34. (In Russ.)
https://doi.org/10.17116/klinderma2015122-34
2.Долгих Т.И. Стратегия и методическое обеспечение диагностики инфекционных заболеваний. Омск: Омская государственная медицинская академия; 2007.
Dolgikh TI. Strategiya i metodicheskoe obespechenie diagnostiki infektsionnykh zabolevanij. Omsk: Omskaya gosudarstvennaya meditsinskaya akademiya; 2007. (In Russ.)
3.Марданлы С.Г., Арсеньева В.А., Захаров М.В. Отечественная тестсистема «Лайн-Блот Сифилис» для диагностики сифилиса методом линейного иммуноблоттинга. Проф мед. 2011;6:24-27.
Mardanly SG, Arsenyeva VA, Zakharov MV. Domestic test system «LineBlot Syphilis» for the diagnosis of syphilis by linear immunoblotting. Prof med. 2011; 6: 24-27. (In Russ.)
4.Марданлы С.Г., Арсеньева В.А., Фриго Н.В. и др. Применение тестсистемы «Лайн-Блот Сифилис» в диагностике сифилиса методом линейного иммуноблотинга. Вестн дерматол венерол. 2011;3:80-87.
Mardanly SG, Arsenyeva VA, Frigo NV, et al. Using the Line Blot Syphilis test system for diagnosing syphilis by the linear immunoblotting method. Vestn dermatol venerol. 2011;3:80-87. (In Russ.)
Поступила в редакцию 27.05.19 Received 27.05.19
Отправлена на доработку 04.12.19 Revision received 04.12.19
Принята к печати 09.12.19 Accepted 09.12.19
Russian Journal of Clinical Dermatology and Venereology 2020, Vol. 19, No. 1 |
23 |
Оригинальные исследования |
Original studies |
Клиническая дерматология и венерология |
Russian Journal of Clinical Dermatology and Venereology = |
2020, Т. 19, № 1, с. 24-30 |
Klinicheskaya dermatologiya i venerologiya 2020, Vol. 19, No 1, pp. 24-30 |
https://doi.org/10.17116/klinderma20201901124 |
https://doi.org/10.17116/klinderma20201901124 |
Иммуногистохимический анализ FOXP3+ Т-регуляторных клеток и его роль в оценке эффективности терапии псориаза
© Ю.А. НОВИКОВ1, В.А. ОХЛОПКОВ2, Д.С. ТРОШИНА1, С.И. МОЗГОВОЙ1, Е.И. ПОЛЕЩУК1, О.В. ПРАВДИНА1
1ФГБОУ ВО «Омский государственный медицинский университет» Минздрава России, Омск, Россия;
2Институт высшего и дополнительного профессионального образования Федерального научно-клинического центра реаниматологи
и реабилитологии Минобрнауки РФ, Москва, Россия
РЕЗЮМЕ Актуальность. В настоящее время большую роль в развитии патологического процесса при псориазе отводят Т-регуляторным клеткам
(Treg). Специфичным маркером Treg является транскрипционный фактор Foxp3. Данные о зависимости экспрессии Foxp3-позитивных
клеток от тяжести и стадийности патологического процесса противоречивы. В связи с этим представляется актуальным изучить экс-
прессию Foxp3+ Т-регуляторных клеток в биоптатах кожи пациентов до и после различных схем лечения, сравнить полученные дан-
ные с результатами предыдущих исследований и сделать вывод о возможности использовать этот маркер для оценки эффективности
терапии псориаза.
Цель исследования — оценить экспрессию Foxp3+ T-регуляторных клеток в псориатических бляшках пациентов при различных имму-
носупрессивных схемах лечения и на основании полученных данных сделать выводы об эффективности каждой из них.
Материал и методы. В 1-ю группу вошли 32 пациента, получавшие узкополосную фототерапию по 4-дневной схеме, во 2-ю группу —
32 пациента, получавшие терапию препаратом натриевой соли синтетического дипептида гамма-D-глутамил-D-триптофана, 32
пациента 3-й группы получали комбинированную терапию — сочетанное применение описанных методик.
Результаты. Исследование показало, что количество Foxp3+-клеточной фракции значительно уменьшается в биоптатах кожи больных
на 21-й день лечения, наиболее выраженным это снижение оказалось у пациентов 3-й группы.
Заключение. Уровень экспрессии маркера Т-регуляторных клеток Foxp3+ при псориазе снижается на фоне проводимой терапии, таким
образом отражая ее эффективность, а также имеет прямую корреляционную связь с PASI и объемом мононуклеарного клеточного инфильтрата, его оценка может рассматриваться в качестве дополнительного критерия регресса заболевания на фоне проводимой терапии.
Ключевые слова: псориаз, узкополосная фототерапия, UVB 311 нм, гамма-D-глутамил-D-триптофан натрия, Foxp3+ Т-регуляторные клетки.
Новиков Ю.А. — http://orcid.org/0000-0003-0391-5372 Охлопков В.А. — http://orcid.org/0000-0002-3515-6027 Трошина Д.С. — http://orcid.org/0000-0002-3912-3863 Мозговой С.И. — http://orcid.org/0000-0001-7200-7082 Полещук Е.И. — http://orcid.org/0000-0002-6778-1089 Правдина О.В. — http://orcid.org/0000-0002-1804-6248
КАК ЦИТИРОВАТЬ:
Новиков Ю.А., Охлопков В.А., Трошина Д.С., Мозговой С.И., Полещук Е.И., Правдина О.В. Иммуногистохимический анализ FOXP3+ Т-регуляторных клеток и его роль в оценке эффективности терапии псориаза. Клиническая дерматология и венерология. 2020;19(1):2430. https://doi.org/10.17116/klinderma20201901124
Immunohistochemical analysis of FOXP3+ T-regulatory cells and its role in evaluating the effectiveness of psoriasis therapy
© YU.A. NOVIKOV1, V.A. OKHLOPKOV2, D.S. TROSHINA1, S.I. MOZGOVOY1, E.I. POLESHCHUK1, O.V. PRAVDINA1
1Omsk State Medical University of the Ministry of Health of Russia, Omsk, Russia;
2Federal Research and Clinical Center of Intensive Care Medicine and Rehabilitology, Moscow, Russia
ABSTRACT
Relevance. Currently, a meaningful role in the development of the pathological process in psoriasis is assigned to T-regulatory cells (Treg).
A specific marker for Treg is the transcription factor Foxp3. Data on the dependence of the expression of Foxp3-positive cells on the severity and staging of the pathological process are contradictory. In this regard, it seemed relevant to study the expression of Foxp3+ T-regulatory cells in skin biopsies of patients before and after various treatment regimens, compare the data with the results of previous studies and conclude that it is possible to use this marker to evaluate the effectiveness of psoriasis therapy.
Study purpose — to evaluate the expression of Foxp3+ T-regulatory cells in psoriatic plaques of patients with various immunosuppressive treatment regimens and, based on the data obtained, draw conclusions about the effectiveness of each of them.
Material and methods. The 1st group included 32 patients who received narrow-band phototherapy according to the 4-day regimen, the 2nd group included 32 patients who received therapy with the sodium salt of gamma-D-glutamyl-D-tryptophan synthetic dipeptide, the 3rd group included 32 patients who received combination therapy with both of the described techniques.
Автор, ответственный за переписку: Трошина Д.С. — |
Corresponding author: Troshina D.S. — e-mail: kastaliya@mail.ru |
e-mail: kastaliya@mail.ru |
|
24 |
Клиническая дерматология и венерология 2020, Т. 19, № 1 |
Оригинальные исследования |
Original studies |
Results. The study showed that the amount of Foxp3+ cell fraction is significantly reduced in the skin biopsy samples of patients on the 21st day of treatment, the decrease was most pronounced in patients of the 3rd group.
Conclusion. The level of expression of the marker of Foxp3+ T-regulatory cells with psoriasis decreases during therapy, thus reflecting its effectiveness, and also has a direct correlation with the PASI index and the volume of mononuclear cell infiltrate, its assessment can be considered as an additional criterion for the regression of the disease against the background of therapy.
Keywords: psoriasis, narrow-band phototherapy, UVB 311 nm, gamma-D-glutamyl-D-tryptophan, Foxp3+ T-regulatory cells.
Novikov Yu.A. — http://orcid.org/0000-0003-0391-5372
Okhlopkov V.A. — http://orcid.org/0000-0002-3515-6027
Troshina D.S. — http://orcid.org/0000-0002-3912-3863
Mozgovoy S.I. — http://orcid.org/0000-0001-7200-7082
Poleshchuk E.I. — http://orcid.org/0000-0002-6778-1089
Pravdina O.V. — http://orcid.org/0000-0002-1804-6248
TO CITE THIS ARTICLE:
Novikov YuA, Okhlopkov VA, Troshina DS, Mozgovoy SI, Poleshchuk EI, Pravdina OV. Immunohistochemical analysis of FOXP3+ T-regulato- ry cells and its role in evaluating the effectiveness of psoriasis therapy. Russian Journal of Clinical Dermatology and Venereology = Klinicheskaya dermatologiya i venerologiya. 2020;19(1):24-30. (In Russ.) https://doi.org/10.17116/klinderma20201901124
Псориаз является хроническим, рецидивирую- |
ко десятилетий разработаны и внедрены многие ви- |
щим иммуноопосредованным дерматозом, которым |
ды фототерапии для лечения псориаза, в том числе с |
страдает 2—3% населения мира. Ухудшение качества |
1988 г. узкополосная фототерапия (NB-UVB) с дли- |
жизни при тяжелом течении псориаза сопоставимо с |
ной волны 311 нм [5]. Действие NB-UVB обусловле- |
раком, инфарктом миокарда и депрессией [1]. В свя- |
но тем, что ультрафиолетовый свет вызывает апоп- |
зи с высокой частотой встречаемости во всем мире и |
тоз кератиноцитов и Т-клеток в эпидермисе и дерме. |
особенностями клинической картины псориаз инте- |
УФ-свет также содействует иммуносупрессии, спо- |
ресует многих ученых как в прикладных, так и в фун- |
собствуя миграции клеток Лангерганса из эпидерми- |
даментальных исследованиях [2]. |
са, уменьшая дегрануляцию тучных клеток и высво- |
Несмотря на постоянно совершенствующиеся |
бождение гистамина [6]. |
методы терапии, данный дерматоз до сих пор неиз- |
Еще один метод системного воздействия на те- |
лечим. К тому же ни один из множества подходов |
чение псориаза — терапия препаратом натриевой со- |
к лечению псориаза нельзя назвать идеальным [1]. |
ли синтетического дипептида гамма-D-глутамил- |
При выборе метода терапии учитывают степень тя- |
D-триптофана. Его иммуносупрессивное действие |
жести и локализацию кожных поражений, связан- |
заключается в подавлении реакций гуморально- |
ные с пациентом особенности (возраст, сопутству- |
го и клеточного иммунитета. Он способен обрати- |
ющие заболевания, предыдущие методы лечения, |
мо снижать общее количество лимфоцитов в пери- |
которые оказались неэффективными) и характери- |
ферической крови, а также уровни Т-хелперов и |
стики самого метода — вопросы эффективности и |
Т-супрессоров. В результате терапии данным препара- |
безопасности. Показанием для назначения систем- |
том уменьшается количество маркеров активации на |
ного лечения является среднетяжелая и тяжелая сте- |
лимфоцитах и подавляется пролиферация Т-клеток. |
пень псориаза [3]. Однако длительное использование |
Важно отметить при этом отсутствие токсичности и |
привычных системных методов ограничено в основ- |
эффективность в низких концентрациях [7]. |
ном плохой переносимостью и кумулятивной ток- |
В настоящее время большую роль в развитии па- |
сичностью, включая гепатотоксичность метотрекса- |
тологического процесса при псориазе отводят Т-ре- |
та, нефротоксичность циклоспорина и канцерогенез |
гуляторным клеткам (Treg). В норме их функция на- |
кожи при фототерапии, в частности при применении |
правлена на подавление воспаления и аутоиммун- |
фотосенсибилизаторов в сочетании с UVA-лучами |
ных реакций. Специфичным маркером Treg является |
(ПУВА) [4]. При тяжелом течении псориаза долго- |
транскрипционный фактор Foxp3, посредством ко- |
срочное использование биопрепаратов более целе- |
торого реализуется их супрессорная активность. Экс- |
сообразно из-за лучшей переносимости и безопас- |
прессия Foxp3 необходима для развития и функцио- |
ности, но большой проблемой остается их высокая |
нирования Т-регуляторных клеток [8]. |
стоимость [3]. Таким образом, актуальной остает- |
По данным предыдущих исследований, оцени- |
ся цель поиска новых эффективных и экономичных |
вающих уровень экспрессии Foxp3+ Т-регуляторных |
схем системной терапии псориаза с минимальными |
клеток среди клеток мононуклеарного инфильтра- |
побочными реакциями. |
та дермы при псориазе, он изменялся в зависимо- |
Фототерапия является одним из старейших мето- |
сти от стадии заболевания — был наиболее выражен |
дов лечения в дерматологии. За последние несколь- |
в прогрессирующей стадии и уменьшался уже в ста- |
Russian Journal of Clinical Dermatology and Venereology 2020, Vol. 19, No. 1 |
25 |
Оригинальные исследования |
Original studies |
ционарной, а также в регрессирующей и коррелировал с PASI [9, 10, 11]. Вместе с тем существуют противоречивые данные о том, что количество Foxp3позитивных клеток в мононуклеарном инфильтрате дермы никак не зависит от тяжести и стадийности заболевания [9] и что уровень экспрессии Foxp3+ возрастает после проведенного лечения [12]. Другие исследователи заявляют, что количество Foxp3+ Т-клеток при псориазе больше в эпидермисе, чем в дерме [13]. Полагают, что причинами этих несоответствий могут быть различия в методологии обнаружения Foxp3-позитивных клеток, количестве исследуемых пациентов, в том числе при разных стадиях заболевания, а также в проводимой терапии [10]. Это побудило нас изучить экспрессию Foxp3+ Т-регуляторных клеток в биоптатах кожи пациентов до и после применения различных схем лечения, сравнить результаты с данными предыдущих исследований и сделать вывод о возможности использовать этот маркер для оценки эффективности терапии псориаза.
Цель исследования — оценить экспрессию Foxp3+ T-регуляторных клеток в псориатических бляшках пациентов при различных иммуносупрессивных схемах лечения и на основании полученных данных сделать выводы об эффективности каждой из них.
Материал и методы
В рамках когортного открытого проспективного рандомизированного контролируемого исследования задействовали 96 больных прогрессирующей стадией вульгарного псориаза, находящихся на стационарном лечении в БУЗ Омской области «ККВД». Исследование проведено согласно разработанному и утвержденному дизайну, представленному в [7].
Тяжесть псориатического процесса и его динамику оценивали с помощью дерматологического индекса — Psoriasis Area and Severity Index (PASI). PASI также является высоковалидным инструментом оценки эффективности терапии. Для вычисления индекса применяли разработанную компьютерную программу.
У всех участников исследования выполняли биопсию кожи до лечения и на 21-й день терапии. Биоптаты кожи окрашивали гистологическим (гематок- силин-эозин) и иммуногистохимическим методами (Foxp3). Гистологическое и иммуногистохимическое исследование биоптатов кожи осуществляли на базе кафедры патологической анатомии ОмГМУ. Забор материала производили с использованием инструмента для биопсии кожи DERMO PUNCH диаметром 4 мм. Под местной инцизионной анестезией 2% раствором лидокаина выполняли биопсию (в пределах дермы) свежих элементов на границе со здоровой кожей до начала лечения и остаточных высыпаний
на 21-й день терапии. Биоптаты фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине (рН 7,2—7,4)
втечение 12—24 ч, заливали в парафин и проводили последующую правильную ориентировку полученного образца (перпендикулярно поверхности кожи, продольно через все слои) для срезов. Парафиновые срезы толщиной 4—5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. В каждом микропрепарате оценивали выраженность мононуклеарного инфильтрата дермы путем количественного подсчета позитивно окрашенных клеток в 10 полях зрения (ув. 400).
Иммуногистохимическое исследование выполняли по стандартной методике. В качестве первичных антител использовали готовые к применению (ready to use — RTU) (не требующие разведения) кроличьи моноклональные антитела FOXP3, клон PCH 101 (Spring Bioscience, США) [14]. При 400-кратном увеличении микроскопа определяли индекс экспрессии T-регуляторных лимфоцитов (ядерная метка Foxp3) как долю (в %) положительно окрашенных клеток среди общего количества мононуклеаров
в10 полях зрения (≥1000 клеток). Микропрепараты просматривали и фотографировали на микроскопе Axioskop 40, используя камеру AxioCam 503 color и программный комплекс ZEN.
Статистическую обработку результатов исследования осуществляли с использованием пакета программ Statistica v.6, Microsoft Office Excel 2016. Описательная статистика количественных признаков представлена медианой и стандартными отклонениями (Mе±σ), также использовали показатели минимума и максимума. Применяли непараметрические методы (критерий Уилкоксона для проверки различий между двумя выборками парных измерений, метод Краскела—Уоллиса для сравнения 3 независимых групп), коэффициент корреляции Спирмена для исследования взаимосвязи двух переменных, измеренных в метрических шкалах на одной и той же выборке (r≤0,3 — слабая связь, 0,3<r<0,7 — связь средней силы, r>0,7 — сильная связь). Результаты считали статистически значимыми при р<0,05.
Результаты
В 1-ю группу включены 32 больных в возрасте от 19 до 60 лет, получивших узкополосную фототерапию. PASI до лечения колебался от 10,2 до 20 (медиана 16,25), после курса UVB 311 нм — от 8 до 1,2 (медиана 2,25). Во 2-ю группу вошли 32 больных в возрасте от 18 до 60 лет, получивших терапию препаратом натриевой соли синтетического дипептида гамма-D-глутамил-D-триптофана. PASI до лечения составил 10—19,5 (медиана 13,9), после текущего курса лечения — 6—1,3 (медиана 3,25). Больные 3-й группы (n=32) получили комбинированную терапию методом UVB 311 нм и препаратом натриевой соли синтетического дипептида
26 |
Клиническая дерматология и венерология 2020, Т. 19, № 1 |
Оригинальные исследования Original studies
гамма-D-глутамил-D-триптофана, возраст боль- |
лее всего объем клеточного инфильтрата уменьшил- |
ных — 18—60 лет. PASI до лечения составил 10—20 |
ся в 3-й группе (рис. 3). |
(медиана 15,6), после текущего курса лечения — от |
В пораженной коже у пациентов до лечения |
5,1 до 0 (медиана 1,75). |
Foxp3+-клетки обнаруживали в основном в сосоч- |
Изначально PASI в группах статистически зна- |
ковом слое дермы, что согласуется с данными дру- |
чимо не различался (Н=5,83; р=0,55) (табл. 1). В ре- |
гих исследований [8, 10, 11, 13] (рис. 4). Экспрес- |
зультате лечения в каждой группе показатели снизи- |
сия Foxp3-позитивных клеток в дерме до лечения |
лись, но больше всего — у пациентов, получивших |
также не имела статистически значимых разли- |
комбинированную терапию (Н=19,65; р=0,000) (см. |
чий в исследуемых группах (Н=0,47; р=0,79) (см. |
табл. 1, рис. 1). |
табл. 1). В окрашенных иммуногистохимическим |
Гистологические и иммуногистохимические |
методом биоптатах кожи, взятых на 21-й день лече- |
ния, отмечено значительное снижение экспрессии |
|
данные |
Foxp3-позитивных клеток в каждой группе (Т=0,00; |
Интенсивность окрашивания мононуклеарного |
р=0,000) (см. табл. 2), причем наиболее выраженное |
дермального инфильтрата гематоксилин-эозином в |
в 3-й группе (Н=36,84; р=0,000) (см. табл. 1, рис. 5). |
биоптатах кожи больных псориазом до лечения не |
Корреляция между различными параметрами |
имела статистических различий между группами, |
|
т.е. была примерно одинаковой (Н=3,14; р=0,2) (см. |
Отмечена положительная корреляция средней |
табл. 1, рис. 2). В результате лечения отмечено зна- |
силы и сильная между PASI и уровнями экспрес- |
чительное снижение количества окрашенных гема- |
сии Foxp3+-клеток, т.е. чем выше PASI при псори- |
токсилин-эозином клеток в каждой группе (Т=0,00; |
азе, тем больше Foxp3+-клеток обнаружено при им- |
р=0,000) (табл. 2), но в группах это снижение было |
муногистохимическом анализе биоптата. Аналогич- |
неодинаковым (Н=27,77; р=0,000) (см. табл. 1) — бо- |
ную корреляцию наблюдали между PASI и объемом |
Таблица 1. Сравнительная динамика PASI, объема клеточного инфильтрата и экспрессии Foxp3+-клеток до начала лечения и на 21-й день терапии
Table 1. Comparative dynamics of PASI, cell infiltrate volume and expression of Foxp3+ cells before treatment and on the 21st day of treatment
Показатель |
1 группа |
2 группа |
3 группа |
Критерий Краскела— |
р |
|
(n=32) |
(n=32) |
(n=32) |
Уоллиса, Н |
|||
|
|
|||||
PASI до лечения, Ме |
16,25 |
13,9 |
15,6 |
5,83 |
0,55 |
|
PASI на 21-й день лечения, Ме |
2,25 |
3,25 |
1,75 |
19,65 |
0,000 |
|
Объем клеточного инфильтрата до лечения, Ме |
106,25 |
91,25 |
92,0 |
3,14 |
0,2 |
|
Объем клеточного инфильтрата на 21-й день лечения, Ме |
55,0 |
62,5 |
36,25 |
27,77 |
0,000 |
|
Экспрессия Foxp3 до лечения, Ме |
12,1 |
11,86 |
11,8 |
0,47 |
0,79 |
|
Экспрессия Foxp3 на 21-й день лечения, Ме |
5,33 |
6,5 |
2,18 |
36,84 |
0,000 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Рис. 1. Пациентка М., 42 года, до начала комбинированной терапии и на 21-й день лечения.
Fig. 1. Patient M., female, 42 y.o., before starting combination therapy and on the 21st day of treatment.
Russian Journal of Clinical Dermatology and Venereology 2020, Vol. 19, No. 1 |
27 |
Оригинальные исследования |
Original studies |
Таблица 2. Интенсивность окрашивания дермального мононуклеарного инфильтрата гематоксилин-эозином и Foxp3-иммуного окрашивания до лечения и на 21-й день терапии
Table 2. The intensity of staining of dermal mononuclear infiltrate with hematoxylin-eosin and Foxp3-immunostaining before treatment and on the 21st day of treatment
|
1 группа |
2 группа |
3 группа |
|
1 |
группа |
2 |
группа |
3 |
группа |
|||||
Критерий |
(n=32) |
(n=32) |
(n=32) |
Foxp3 |
(n=32) |
(n=32) |
(n=32) |
||||||||
|
до |
21 день |
до |
21 день |
до |
21 день |
|
до |
21 день |
до |
21 день |
до |
21 день |
||
Медиана |
106,25 |
55,0 |
91,25 |
62,5 |
92,0 |
36,25 |
|
12,1 |
5,33 |
11,86 |
6,5 |
11,8 |
2,18 |
||
Min |
42,5 |
20,0 |
40,0 |
30,5 |
50,0 |
14,0 |
|
|
10,1 |
0,3 |
2,78 |
0,63 |
5,78 |
0,0 |
|
Max |
185,0 |
115,0 |
175,0 |
120,0 |
180,0 |
70,0 |
|
|
15,46 |
10,77 |
29,33 |
25,45 |
23,3 |
6,2 |
|
Стандартное |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
отклонение |
40,92 |
23,88 |
36,09 |
27,53 |
25,49 |
14,05 |
|
1,43 |
2,48 |
6,55 |
5,3 |
3,94 |
1,65 |
||
Уилкоксона, Т |
|
0,00 |
|
0,00 |
|
0,00 |
|
|
|
|
0,00 |
|
0,00 |
|
0,00 |
р |
0,000 |
|
0,000 |
|
0,000 |
|
|
|
0,000 |
|
0,000 |
|
0,000 |
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Рис. 2. Объем мононуклеарного инфильтрата в псориатической бляшке до начала терапии. Окраска гематоксилином и эозином; ув. 200.
Fig. 2. The mononuclear infiltrate in the psoriatic plaque before starting therapy. Stained with hematoxylin and eosin; magn. ×200.
Рис. 3. Объем мононуклеарного инфильтрата в псориатической бляшке на 21-й день лечения по комбинированной схеме. Окраска гематоксилином и эозином; ув. 200.
Fig. 3. The mononuclear infiltrate in the psoriatic plaque on the 21st day of treatment. Stained with hematoxylin and eosin; magn. ×200.
Рис. 4. Foxp3+-клетки в псориатической бляшке до начала лечения. Иммуногистохимия (Foxp3, ув. 200).
Fig. 4. Foxp3+ cells in a psoriatic plaque before treatment. IHC test (Foxp3, magn. ×200).
Рис. 5. Foxp3+-клетки в псориатической бляшке на 21-й день комбинированной терапии. Иммуногистохимия (Foxp3, ув. 200).
Fig. 5. Foxp3+ cells in a psoriatic plaque on the 21st day of treatment. IHC test (Foxp3, magn. ×200).
28 |
Клиническая дерматология и венерология 2020, Т. 19, № 1 |