I.Цито- и гистохимические методы исследования

Цито- и гистохимические методы позволяют выявлять химические соединения различных классов в структурах клеток и тканей, а также их локализацию. Специфичность химической реакции в ряде случаев может быть проверена с помощью дополнительного контроля (например, путем предварительного расщепления соответствующим ферментом).

В основу цито- и гистохимических методов исследования положен ряд принципов.

1. Избирательное окрашивание, при котором определенные химические группировки внутриклеточного вещества вступают в реакцию с красителем.

2. Избирательное растворение красителя в определенном субстрате, характеризующем клеточную структуру.

3. Перевод некоторых неактивных химических соединений, неспособных взаимодействовать с красителем, в активное состояние.

4. Получение с помощью промежуточных реакций неокрашенного продукта с последующим переводом его в окрашенный.

Так, специфичной для выявления ДНК является реакция Фельгена, которая основана на том, что альдегидные группы дезоксирибозы восстанавливают окраску основного фуксина, предварительно обесцвеченного сернистой кислотой (реактив Шиффа). В результате реакции хроматин окрашивается в пурпурно-красный цвет. Для одновременного выявления ДНК и РНК часто применяют метод Браше с использованием метилового зеленого и пиронина. При этом способе метиловый зеленый окрашивает ДНК хромосом в зеленый цвет, а пиронин окрашивает РНК ядрышек и цитоплазмы в красный цвет.

Выявление гликогена, гликопротеинов, гликолипидов — соединений, содержащих сахара, основано на окислении гликолевых групп последних до альдегидов с последующим взаимодействием с реактивом Шиффа. Продукт реакции окрашивается в различные оттенки пурпурно-красного цвета. В случае выявления гликозаминогликанов (гиалуроновая кислота, хондроитинсульфат, кератансульфат, гепарансульфат, гепарин) используют способность их анионных групп связываться при низких значениях рН с основными красителями или давать метахроматическое окрашивание с тиазиновыми красителями — толуидиновым синим, азуром.

Выявление липидов основывается на их способности окрашиваться растворенными в них красителями, например Суданом.

Сочетание цито- и гистохимических методов исследования с методом электронной микроскопии послужило основой развития электронной гистохимии.

II. Электронная микроскопия

Многие структуры клетки находятся за пределами разрешающей способности светового микроскопа. Длина волны видимой части спектра лежит в пределах от 0,4 до 0,7 мкм, максимальное разрешение, полученное при этом с помощью светового микроскопа, может составлять 0,2 мкм. Открытие волновых свойств, присущих электронам, послужило основой для создания нового класса приборов — электронных микроскопов.

Максимальное разрешение, которое может быть получено в них при специальных условиях, составляет 0,2 нм, а увеличение может достигать 100— 200 тыс. раз.

Принципы работы электронного микроскопа

Принципиальная схема построения изображения в световом и электронном микроскопах сходна. Однако существует ряд отличий: в электронных микроскопах источником электронов служит катод, входящий в состав электронной пушки, в качестве линз используются электромагнитные катушки. В связи с тем, что в воздухе электроны могут проникать на незначительные расстояния, а затем их скорость гаснет, в электронном микроскопе с помощью специальных насосов создается высокий вакуум (10~4 мм рт. ст.).

В колонне микроскопа (тубусе), из которой откачан воздух, последовательно расположены катод (вольфрамовая нить), анод (металлическая пластинка с отверстием посередине), магнитные линзы, люминесцентный экран, фотопластинки ("магазин").

Ток, проходя через вольфрамовую нить катода, нагревает ее и вызывает эмиссию электронов. Поданное на катод высокое напряжение создает большую разность потенциалов между катодом и анодом, что обеспечивает движение электронов к аноду и далее вниз по колонне микроскопа. Электронный пучок сначала фокусируется первой магнитной линзой — конденсорной. Большая часть электронов, проходя через объект, не отклоняется. Электроны, прошедшие через объект, фокусируются второй магнитной линзой — объективной, которая дает увеличенное изображение объекта. Это изображение снова увеличивается третьей магнитной линзой—проекционной.

При этом электроны, которые проходят через объект, вызывают свечение экрана, покрытого люминофором, а отклонившиеся электроны не доходят до экрана и не вызывают свечения. Изображение, полученное на люминесцентном экране, можно сфотографировать, если поднять экран, под которым расположен фотомагазин с фотопластинками, чтобы пучок электронов попал на фотопластинку.