II. Фиксация – метод обработки живого объекта фиксирующими веществами с целью сохранения прижизненной структуры органа или ткани.

Механизм фиксации основан на коагуляции белков.

Виды фиксаторов:

А) Физические:

1.холод (замораживание)

2.лиофильная сушка (сушка на морозе)

Б) Химические:

1. Простые – состоят из одного ингредиента:

- 10% формалин

- 96% спирт, ацетон

- 2% осмиевая кислота (для электронной микроскопии)

- трихлоруксусная кислота 5-10% раствор

- пикриновая кислота (2% раствор)

- 5% уксусная кислота

- соли тяжелых металлов: ртути (сулема), платины, урана и др.

- сульфосалициловая кислота

2. Сложные:

- смесь Буэна (пикриновая кислота, формалин, уксусная кислота)

- смесь Карнуа (спирт, формалин, уксусная кислота)

- смесь Ценкера (бихромат калия, сернистый натрий, сулема, уксусная кислота)

Правила фиксации:

1. Объем фиксатора в 20-40 раз должен превышать объем фиксируемого объекта.

2. Время фиксации определяется объемом кусочка и выбором фиксатора.

3. Выбор фиксатора зависит от целей и задач исследователя.

III. Промывка в воде – для водорастворимых фиксаторов и в спирте – для спирторастворимых фиксаторов.

Цель: освобождение от фиксатора.

IV. Обезвоживание и уплотнение - проводят по батарее спиртов возрастающей концентрации (крепости).

Основное правило: правило постепенного воздействия применяемых веществ на исследуемые ткани.

Если применяли водорастворимый фиксатор, тогда батарея спиртов следующая:

30⁰→40⁰→50⁰→60⁰→70⁰→80⁰→90⁰→96⁰ I→96⁰ II→100⁰ абсолютный спирт

Если применяли спирторастворимый фиксатор, батарея спиртов начинается с 70⁰ спирта: 70⁰→80⁰→90⁰→96⁰I→96⁰ II→100⁰ абсолютный спирт

V. Заливка – пропитывание веществами представляющими собой плотные среды. Заливку производят в парафин и в целлоидин.

А) Парафиновая заливка

Парафин не растворяется в спирте, зато растворяется в органических растворителях (бензол, ксилол, толуол, хлороформ). Прежде чем материал залить в парафин, его нужно провести через ряд промежуточных сред:

спирт + ксилол → ксилол I → ксилол II → ксилол + парафин (t = 37⁰) → парафин I (t = 56⁰) → парафин II(t = 56⁰) → заливочный парафин (содержит 5% воска)

Положительные стороны парафиновой заливки:

1. Можно делать тонкие срезы ≈ 5 мкм

2. Относительная быстрота проводки: время нахождения в различных средах зависит от структуры органа и размера кусочка и подбирается опытным путем.

Отрицательные стороны парафиновой заливки:

1. Воздействие на объект высоких температур, что часто приводит к высушиванию и деформации материала.

2. Возможность заливать только мелкие объекты

Б) Целлоидиновая заливка

Целлоидин – это нитроклетчатка, для этой цели используют рентгеновские пленки, которые растворяются в смеси спирт + эфир. Получается жидкий целлоидин. Проводку осуществляют в последовательности:

Спирт + эфир → 2% целлоидин → 4% целлоидин → 6% целлоидин → 8-10% целлоидин. Далее помещают заливаемый объект в чашку Петри с 10% целлоидином и приоткрывают крышку, чтобы среда получилась эластичной. Затем вырезают объект вместе со средой и приклеивают с помощью густого целлоидина к деревянному блоку. Такой гистологический блок хранят в банке с 70-градусным спиртом, чтобы предотвратить от высыхания. Парафиновые блоки можно хранить при комнатной температуре.

Положительные стороны парафиновой заливки:

1. можно заливать более крупные объекты

Отрицательные стороны парафиновой заливки:

1) невозможность получить тонкие срезы, толщина срезов =20 мкм