20

Глава 2

Общая характеристика материалов и методов исследования

Медико-биологические исследования в основном проводятся с объектами и явлениями, ко- торые характеризуются многокомпонентностью и многофакторностью. Это, несомненно, предъяв- ляет определенные требования к объективности и достоверности полученных результатов [Автан- дилов Г.Г., 1990]. В данной работе с целью комплексного решения поставленных задач мы осно- вывались на рациональном использовании, с одной стороны, качественного и количественного анализа морфологических данных, с другой — общепринятых и специальных морфологических методов исследования материала, которые позволили бы применить достигнутые результаты в по- вседневной практической экспертной деятельности.

Проведено 50 экспериментальных исследований по моделированию ушибов сердца на жи- вотных, которые составили 1-ю группу наблюдений.

Используемый в работе практический судебно-медицинский секционный материал получен

втанатологическом отделе Новосибирского областного бюро судебно-медицинской экспертизы за период 1998-2000 гг. от погибших в результате изолированной и сочетанной видов травм, сопро- вождающихся повреждениями сердца, и умерших скоропостижно от ишемической болезни сердца (ИБС). Всего исследовано 114 трупов лиц обоего пола в возрасте от 18 до 65 лет.

В57 случаях наблюдались сочетанные и множественные повреждения тела, сопровождаю- щиеся тупой травмой грудной клетки с повреждением сердца (СУС), возникшие при различных видах транспортных происшествий, падении пострадавших с большой высоты. Эти исследования составили 2-ю группу наблюдений.

В23 рассмотренных случаях причиной смерти послужили изолированные ушибы сердца (ИУС), возникшие при ударных травматических воздействиях тупыми твердыми предметами с ог- раниченной поверхностью соударения (кулаками либо обутыми ногами) по передней поверхности грудной клетки в проекции сердца. Эти случаи составили 3-ю группу наблюдений.

Скоропостижно умершие от ишемической болезни сердца (34 случая), вошедшие в 4-ю группу, исследованы с целью определения дифференциально-диагностического значения измене- ний кардиомиоцитов.

Верификация причин смерти проводилась в полном соответствии с международной класси- фикацией болезней X пересмотра. С целью единого унифицированного подхода, исключающего артефакцию вследствие начавшегося аутолиза, давность смерти во всех исследованных случаях не превышала 24 ч.

Распределение количественных показателей умерших по полу, возрасту и причине смерти, а также их общее число представлены в табл. 2.1.

Как следует из табл. 2.1, количество умерших мужчин значительно превышало количество женщин, и их соотношение составило соответственно 85 и 29 случаев. Такое соотношение не яв- ляется результатом искусственного подбора материала, а характеризует существующее соотноше- ние умерших по полу, исходя из действительных данных секционного материала танатологиче- ского отдела.

С целью проведения сравнительной оценки возникновения патоморфологических изменений

вмиокарде при ушибе сердца в случаях из экспертной практики и при экспериментально полу-

ченном ушибе сердца у животных нами осуществлено моделирование этого вида травмы с использованием крыс.

Для экспериментов использованы белые крысы-самцы «Вистар». Все животные выращены в стандартных условиях вивария до возраста 2-3 мес и массы 180-220 г на стандартном пищевом раиионе.

Ушиб сердца моделировали путем удара грузиком массой 50 и 100 г при ускорении свобод- ного падения с высоты 50 см. Площадь соударяющей поверхности груза составляла 1 см2. Точка воздействия травмирующей силы определялась в области сердечной пульсации на передней по- верхности грудной стенки. Возникающие изменения в деятельности сердца в момент удара и по- сле него регистрировались электрокардиографически. Всего проведено 50 экспериментов с ане- стезией животных диэтиловым эфиром. В качестве контрольной группы использованы 5 живот- ных, которых под анестезией декапитировали.

При проведении различных видов микроскопии ушибов сердца, полученных при экспери- ментальном моделировании этого вида травмы на экспериментальных животных, исследовано 55 объектов при 110 ориентациях и 550 объектов исследования (срезов).

2.1. Последовательность выполнения работы и методы исследования

Работы проводили в рамках строгого соблюдения определенного порядка последовательно- сти этапов и методов исследования.

1.На первом этапе моделировали ушиб сердца на экспериментальных животных. При этом осуществляли обязательный электрокардиографический контроль. Формировали контрольную группу экспериментальных животных.

2.Далее изучали и учитывали повреждения, обнаруженные при исследовании трупов живот- ных, проводили забор материала Для микроскопического исследования.

3.Микроскопическое исследование выполняли с помощью световой, поляризационной, фа- зово-контрастной микроскопии и фотохимического флюорохромирования, использовалась мор- фометрия.

4.На основании полученных данных сформировали базу данных с последующим ее анали- зом и статистической обработкой, которая составила 1-ю группу наблюдений.

5.На следующем этане работы осуществляли сбор информации: уточняли обстоятельства наступления смерти лиц, трупы которых поступали в танатологическое отделение; изучали сведе- ния об обстоятельствах дела, изложенные в постановлениях о назначении судебно-медицинской экспертизы, протоколы осмотра места происшествия, сопроводительные листы скорой помощи, амбулаторные карты умерших (в случаях их предоставления). Далее проводили предварительный отбор случаев и формировали исследуемые нозологические группы.

6.Изучали и учитывали повреждения, обнаруженные при наружном и внутреннем исследо- вании, а также патологические изменения, их характер и выраженность, которые нашли отражение

взаключениях судебно-медицинских экспертов и актах исследования трупа.

7.В процессе судебно-медицинского исследования трупов выполняли забор материала для последующего расширенного микроскопического и гистохимического видов исследования мио- карда сердца.

8.Для исключения каких-либо патологических состояний, которые могли повлиять на мор- фологию кардиомиоцитов, в каждом случае исследовали кусочки внутренних органов: головного

22

мозга, легких, печени, почек, селезенки, надпочечников, желудка, кишечника.

9.Проводили детальное микроскопическое исследование сердечной мышцы с использовани- ем световой, поляризационной, фазово-контрастной микроскопии, фотохимического флюорохро- мирования, а также специальных методов окрасок (по Ван-Гизону, Вейгерту, Перлсу, осуществля- ли ШИК-реакцию, ШИК-ре-акцию с контролем амилазой), в том числе с применением морфомет- рии.

10.В каждом наблюдении ушиба сердца (2-я и 3-я группы) и ИБС (4-я группа) исследовали кровь и мочу для количественного определения этилового алкоголя газохроматографичёским ме- тодом. Исследование выполняли в судебно-химическом отделении Новосибирского областного бюро судебно-медицинской экспертизы.

11.Окончательное формирование изучаемых групп происходило на основании анализа дан- ных, выводов заключений и актов судебно-медицинского исследования трупов, результатов мик- роскопического и гистохимического исследования миокарда.

12.С учетом предварительно формализованной информации о наблюдениях и результатах проведенных исследований сформированы соответствующие группы, которые стали составляю- щими базы данных.

13.На следующем этапе исследования показатели базы данных подвергали анализу и стати- стической обработке.

14.На заключительном этапе оформляли окончательное представление полученных резуль- татов проведенного исследования по судебно-медицинской оценке морфологических изменений миокарда при ушибах сердца в случаях дифференциальной диагностики с сопутствующей сердеч- но-сосудистой патологией.

Макроскопическое исследование сердца проводили по методике А.И. Абрикосова [1936]. При этом отмечали наличие либо отсутствие повреждений (разрывы, кровоизлияния), состояние венечных сосудов, степень поражения их атеросклерозом (оценка предложена Г.Г. Автандиловым [1970, 1990]), состояние миокарда, наличие в нем склеротических изменений, количество жировой клетчатки, массу и размеры различных отделов сердца.

Забор кусочков из сердца для микроскопического исследования осуществляли последова- тельно, в соответствии с рекомендациями Ю.Г. Целлариуса, Л.А. Семеновой и Л.М. Непомнящих

[1980].

На рис. 2.1 представлена схема забора материала для микроскопического исследования:

— образцы 1-3 вырезали от основания сердца к его верхушке, параллельно поверхности бо- кового разреза левого желудочка;

— образец 4 брали из верхушечного отдела стенки левого желудочка;

— образцы 5, 6 — из середины предварительно продольно рассеченных папиллярных мышц;

— образцы 7,8 —с поверхности бокового разреза стенки правого желудочка;

— образцы 9, 10 — из межжелудочковой перегородки.

В 28 исследованиях забор материала для микроскопического исследования проводили су- дебно-медицинские эксперты без предварительной рекомендации.

Изъятые кусочки маркировали и фиксировали в 12% растворе нейтрального формалина. Гис- тологические препараты изготавливали путем заливки кусочков в парафин с последующей про- водкой и окраской срезов гематоксилин-эозином [Меркулов Г.А., 1961].

23

Рис. 2.1. Схема забора гистологического материала.

Для определения паренхиматозно-стромальных взаимоотношений миокарда применяли ок- раску по Ван-Гизону в сочетании с резориин-фуксином по Вейгерту. Окрашивание проводили по прописи Ю.Г. Целлариуса [1974]. Такая окраска позволяла ориентироваться в стромальных реак- циях миокарда, последующих за повреждением мышечных клеток сердца. Тем самым облегчалось различение острых повреждений мышечных клеток от фона предыдущих патологических измене- ний ткани миокарда. Пикрофуксин, используемый в этой окраске, обладает специфичностью по отношению к белково-полисахаридным комплексам соединительной ткани, а резорцин-фуксин окрашивает эластику, в результате чего мышечная ткань приобретала желтоватые оттенки, соеди- нительная ткань с коллагеновой основой — красноватые, эластика — серо-черные.

При исследовании части материала проводили окрашивание препаратов гематоксилин- эозином в сочетании с предварительной постановкой реакции Перлса. Реакция Перлса позволяет

обнаружить отложение гемосидерина в местах нарушения проницаемости кровеносных сосудов и служит контролем при выявлении гликозаминогликанов коллоидным железом [Циммерман В.Г., 1994]. В ходе реакции Перлса ионы ферроцианида калия в кислой среде при контакте с ионами железа образуют берлинскую лазурь — структуры, содержащие ионы трехвалентного железа, ок- рашиваются в оттенки от синего до синевато-зеленоватых.

Комбинированное окрашивание проводили по рекомендациям Ю.Г. Целлариуса и Л.А. Се- меновой [1972]. При комбинированном окрашивании, сочетающем ШИК-реакцию, коллоидное железо по Хейлу и гематоксилин-оранж, хорошо дифференцируются клеточные элементы: кислые мукополисахариды, гликозаминогликаны, гликоген, базальные мембраны, ретикулярные волокна, гликопротеиды.

Кроме того, проводили ШИК-реакцию с контрольной обработкой срезов амилазой. Реакцию осуществляли по прописи Мак-Мануса. Обработка ШИК положительных срезов амилазой позво- ляет судить о нарушениях проницаемости сарколеммы кардиомиоцитов и их плазматическом про- питывании [Целлариус Ю.Г., Семенова Л.А., 1972]. Эта окраска дает возможность оценить необ- ратимость повреждения клеток без использования иммуногисто-химических методов обнаруже- ния белков плазмы в саркоплазме.

Помимо световой микроскопии в работе применяли поляризационную, фазово-контрастную микроскопию, а также фотохимическое флюорохромирование (Циммерман в.Г., Целлариус Ю.Г., 1976. 1978, 1980]. Указанные методы позволили выявить и дифференцировать некробиотические и дегенеративно-дистрофические изменения кардиомиоцитов.

С помощью поляризационной микроскопии выявлялись ранние стадии повреждения кардио- миоцитов вследствие различных причин, что отражаюсь на их двулучепреломлении.

Для поляризационного и фазово-контрастного исследований изготавливали неокрашенные срезы толщиной 5—10 мкм, при этом мышечные волокна интересующего нас слоя миокарда рас-

24

полагались продольно. Для фазово-контрастного исследования препараты не заключали в твер- дые среды.

При фотохимическом флюорохромировании использовали де-парафинированные, неокра- шенные срезы, смонтированные на обычных непокрытых белком стеклах, облученные коротко- волновым ультрафиолетом (исключение белка при приготовлении срезов обеспечивало отсутствие аутолюминесцентного влияния). Источником коротковолнового облучения служила ртутно- кварцевая лампа ДРК-120 в стандартном люминесцентном осветителе ОИ-18 на расстоянии 120 мм от лампы до препарата. Предметное стекло размещалось открытым препаратом со стороны лампы. Время облучения составляло 120-180 мин. Фотохимическое флюорохромирование, как и поляризационная микроскопия, позволила обнаружить разнообразные патологические изменения миофибрилл практически сразу после повреждающего действия, но при этом оказалось возмож- ным исследование как продольных, так и поперечных срезов миокарда.

На основе классификации повреждений миофибриллярного аппарата кардиомиоцитов с ак- центом на поляризационно-оптическую картину их отображений проводили сравнительное люми-

несцентное микроскопическое изучение фотофлюорохромированных гистологических препаратов миокарда в сочетании с наблюдением фазового контраста и исследованием окрашенных препара- тов в светлом и поляризационном полях.

Использовали люминесцентный микроскоп МЛ-2Б, микроскопы фирмы «Carl Zeiss» с поля- ризационными и фазовыми насадками. КУФ-облучение препаратов проводили отдельно, под осветителем ОИ-18. Обычные условия облучения — на воздухе, с возможной дифференцировкой при необходимости. В этом случае препараты промывали в дистиллированной воде 10 мин, что

позволяло повысить контрастность между элементами среза при некотором снижении интенсивности люминесценции. Затем их высушивали на воздухе и заключали в нелюминесцирующее масло или полистирол.

При облучении препаратов миокарда коротковолновым ультрафиолетом образуются фото- продукты, способные светиться в видимой области при возбуждении длинноволновым ультрафио- летом лампы люминесцентного микроскопа с интенсивностью, достаточной для детального мик- роскопического анализа [Циммерман В.Г., Целлариус Ю.Г., 1976].

Фотографирование в свете люминесценции осуществляли с помощью фотонасадки МФН-10 микроскопа МЛ-2Б. Применяли пленку Фото-64, которую проявляли удвоенное время. При этом примерно вдвое увеличивалась чувствительность пленки, повышался коэффициент контрастности, а зернистость изображения оставалась удовлетворительной.

Фотографирование на остальных микроскопах выполняли фотонасадкой mf-matic с блоком автоматической установки экспозиции.

Всего исследовано 954 объекта, 1387 ориентации, 3420 объектов исследований (срезов). Со-

отношение количества объектов и объектов исследования в группах наблюдения представлено в табл. 2.2.

В случаях проведения морфометрического исследования материал обрабатывали в условиях строгой унификации. В соответствии с рекомендациями Л.М. Непомнящих и соавт. [1991] для этой цели использовали папиллярные мышцы левого желудочка, так как они легко доступны фик- сации, в них отсутствуют клетки проводящей системы, а мышечные волокна идут параллельно и их легко ориентировать в препаратах. Кроме того, в папиллярных мышцах возникают поврежде- ния, характерные для всего миокарда в целом.

При микроскопическом исследовании препаратов сердца регистрировали состояние оболо- чек сердца, степень кровенаполнения сосудов артериального, венозного и микроциркуляторного русла, наличие и характер патологических изменений стенок сосудов и окружающих сосуды тка- ней. При рассмотрении мышечных слоев миокарда учитывали состояние сокращения мышечных волокон, наличие или отсутствие между пучками волокон очагов соединительной ткани, жировой клетчатки, выраженность продольной и поперечной исчерченности, наличие участков фрагмента- ции и волнообразной деформации кар-диомиоцитов.

Регистрировали состояние сократительного аппарата мышечных волокон, степень их сокра- щения, а также наличие контрактурных изменений, их характер и локализацию. Кроме контрак- турных изменений учитывали и другие очаговые повреждения кардиомиоцитов (первичный глыб- чатый распад, миоцитолизис). Отмечали состояние гипертрофии и атрофии кардиомиоцитов, на-

25

личие и характер включений липофусцина.

Т а б л и ц а 2.2

Соотношение количества объектов, срезов и объектов исследования в трех группах наблюдения

2.2. Математическая обработка, регистрируемые параметры материала и оборудование для исследования

Существующие в настоящее время масштабные данные по патоморфологическим изменени- ям в сердце, объем которых из года в год продолжает расти на основе использования новых мето- дов исследования, должны дополняться комплексными количественными научно обоснованными исследованиями [Автандилов Г.Г., 1990].

Поэтому закономерным и, как правило, вторым этапом каждого исследования должно стать системное медицинское морфометрическое исследование, предполагающее обязательное последо-

вательное проведение после описания морфологического объекта собственно морфологического изучения (включающего подсчет и измерение изучаемых объектов) и статистического анализа, выявление и уточнение наиболее существенных признаков, характеризующих исследуемое явле- ние или объект.

Полученные данные в соответствии с критериями, представленными в перечне учитываемых параметров, фиксировали в разработанной нами регистрационной карте. На начальном этапе ис- следования выраженность признака оценивали в каждом препарате всех четырех групп исследо- вания по трехбалльной шкале оценок:

•0 баллов — отсутствие признака;

•1 балл — слабая выраженность;

•2 балла — значительная выраженность.

Для получения количественных данных патоморфологических изменений в миокарде и в по- следующем, с целью дифференциальной диагностики с имеющейся сердечно-сосудистой патоло- гией, проводили подсчет числа субсегментарных контрактур кардиомиоцитов для выяснения час- тоты их встречаемости при различных видах смерти во всех четырех группах наблюдений.

Подсчет субсегментарных контрактур кардиомиоцитов осуществляли при увеличении (объ- ектив х40, бинокулярная насадка х1,6, окуляр х10 = 640) в каждом третьем поле зрения микроско- па в субэпикардиальном, интрамуральном и субэндокардиальном слоях миокарда левого и право- го желудочков сердца. В каждом слое миокарда исследовали не менее 10 полей зрения. В полях зрения, расположенных в непосредственной близости к краям среза и в очагах макроскопических повреждений (разрывы, кровоизлияния) подсчет субсегментарных контрактур не проводили. Для вычисления значимости долей признаков (%) использован критерий (угловое преобразование Фи- шера), как эффективный способ для оценки различий между выборками, в которых зарегистриро- ван интересующий эффект.

Кроме того, применяли метод последовательного анализа [Гублер Е.В., 1990] с составлением таблицы значимости признаков для дифференциальной диагностики изолированных ушибов серд- ца и ишемической болезни сердца.

Перечень регистрируемых параметров

I.Общие сведения:

1)порядковый номер;

27

46)левый желудочек;

47)межжелудочковая перегородка;

48)папиллярные мышцы левого желудочка.

XII. Морфометрические показатели:

49)угловое преобразование (Фишера);

50)патометрические алгоритмы.

Проведение морфологического исследования невозможно без современного технического обеспечения средствами, необходимыми для регистрации и обработки полученных данных. В то же время это предполагает наличие их в каждом территориальном бюро судебно-медицинской экспертизы. В ходе выполнения работы использовались следующие технические средства и про- граммное обеспечение:

•при проведении микроскопического исследования — микроскоп биологический «Биолам- И», микроскоп «Люмам Р-8», люминесцентный микроскоп МЛ-2Б, микроскопы «Carl Zeiss», ртут- но-кварцевая лампа ДРК-120, цифровая камера «Scanmicro C» для микрофотосъемки, монокуляр- ная фотонасадка МФН-10 микроскопа МЛ-2Б, фотонасадка mf-matic с блоком автоматической ус- тановки экспозиции, объект-микрометр, микрометр винтовой МОВ-1-15, окулярная квадратно- сетчатая вставка;

•в процессе формирования базы данных, статистической обработки данных и оформления полученных результатов — персональные IBM-совместимые компьютеры, Office-программы и пакет STATISTIKA.

•после статистической обработки полученных морфометрических показателей составлены индивидуальные формализованные информационные бланки, объединенные в диагностическую таблицу.