2 курс / Гистология / Марченко_Н_В_Клинико_морфологические_и_психоэмоциональные_взаимосвязи

2.2Методы исследования

2.2.1Клинические методы исследования

Обследование пациентов проводилось в условиях терапевтического отделения ГКБ № 31. Изучались жалобы, данные анамнеза заболевания и анамнеза жизни.

73

Все пациенты подписывали добровольное информированное согласие на заполнение психологических методик и на медицинские исследования.

2.2.2Лабораторные методы исследования

2.2.2.1Общеклинические и иммунологические лабораторные методы

Всем пациентам выполнялось исследование клинического и биохимического состава крови. Забор крови для клинического анализа и биохимических исследований производили после 12-часового голодания в утренние часы путем венепункции локтевой вены. Определение количества эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина, тромбоцитов проводилось с помощью автоматического анализатора, для определения СОЭ использовался капилляр Вестергрена. После центрифугирования в сыворотке крови согласно общепринятым методикам определялась активность ферментных маркеров цитолиза (аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы) и холестаза (щелочной фосфатазы, γ-глутамилтрансферазы), уровни общего и прямого билирубина, общего белка и его фракций, показателей коагулограммы (МНО). Данные лабораторные исследования выполнялись в клинико-диагностической лаборатории ГКБ № 31 г. Санкт-Петербурга. Выполнялось определение уровней иммуноглобулинов M, G. Исследование проводилось стандартным методом радиальной иммунодиффузии (РИД) по Манчини с использованием набора реагентов Моно-РИД-G, M Сыворотки диагностические моноспецифичные против IgG (H), IgM (H) человека сухие (ФГУП НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России, г. Москва) в лаборатории иммунологии ГКБ № 31.

Всем пациентам выполнялось определение специфичных аутоантител с применением серологических методов. Данные исследования проводились в лаборатории диагностики аутоиммунных заболеваний печени СПбГМУ им. ак. И.П. Павлова. Выявление антинуклеарных антител (ANA) осуществлялось методом нРИФ в оригинальной модификации, с использованием в качестве субстрата клетки перевиваемой клеточной линии аденокарциномы гортани человека НЕр-2 и нейтрофильных лейкоцитов здорового донора. В лунки с

74

клеточным субстратом вносилась сыворотка больных в разведении 1/40. В

течение 10 минут проводилась отмывка в фосфатно-солевом буфере (ФСБ). Для выявления образовавшихся иммунных комплексов использовалась 30-минутная инкубация с кроличьей сывороткой против IgG человека, меченая флюоресцеином (DAKO, Дания). После отмывки ФСБ в течение 10 минут срезы монтировали в глицерин, забуференный ФСБ (10:1, pH 8.2). Оценка результата проводилась с помощью люминесцентного микроскопа (EUROStar, Германия).

При выявлении у пациента АNA, описывался тип свечения и проводилось определение конечного титра аутоантител. Для стандартизации данного метода была использована референтная сыворотка ВОЗ AF/CDC1, которая содержит 100

МЕ/мл с гомогенным типом свечения ядра, что соответствует разведению сыворотки 1/160.

Для выявления антигладкомышечных (АSMA) и антимитохондриальных антител (AMA) использовался метод нРИФ на криосрезах комбинации тканей крысы – желудка, почки и печени. Криосрезы толщиной 5 мкм наносились на стекла с адгезивным покрытием (амино-три-этокси-силан). Сыворотка больных и контрольная сыворотка вносились в лунки в разведении 1/40. Использовалась антисыворотка против иммуноглобулинов человека, меченая флюоресцеином.

Результат реакции описывался в виде конечного титра. Выявление АSMA

подтверждалось реакцией против гладкомышечных компонентов слизистой желудка крысы, стенки сосудов почки и печени. Обнаружение АМА характеризовалось свечением богатых митохондриями структур, таких как слизистая желудка, эпителий проксимальных канальцев почки и центролобулярных клеток печени. Для обнаружения антител к антигенам аутоиммунных заболеваний печени, таких как пируватдекарбоксилазный комплекс (PDC/AMA-M2), основной эпитоп антимитохондриальных антител 2

типа (M2-3E), растворимый печеночный антиген (SLA/LP) использовалась коммерческая тест-система, основанная на методе лайн-блот с рекомбинантными антигенами (EUROLine, Liver profile (IgG), EUROIMMUN, Германия).

75

Всем пациентам выполнялось иммунологическое обследование с целью исключения патологии печени вирусной этиологии – вирусы гепатиа В и С в фазе репликации.

У 31 пациента (11 — с ПБЦ, 10 — с АИГ и 10 — с ХГС) однократно определялся уровень фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-α) в сыворотке крови.

Исследование проводилось в лаборатории иммунологии ГКБ № 31. Определение ФНО-α выполнялось стандартной методикой твердофазового иммуноферментного анализа сэндвич-типа с использованием набора «альфа-

ФНО-ИФА-БЭСТ» (ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск, Россия) с регистрацией результатов на фотометре Sunrise (Tecan, Австрия).

2.2.2.2 Генетическое исследование

Частоты аллелей полиморфных вариантов гена TNF-α (-308 G/A и -238 G/A)

исследовались у 37 пациентов с АИЗП и 146 человек из контрольной группы.

Генотипирование ДНК проводилось однократно в момент включения в исследование в лаборатории молекулярной генетики ГКБ № 31. Контрольная группа сформирована из неродственных индивидуумов, не имеющих признаков АИЗП на момент сбора материала, соответствовала популяционной выборке проживающих на территории Санкт-Петербурга и Ленинградской области.

Геномную ДНК из крови выделяли из 10 мл периферической крови по стандартной методике с использованием протеиназы К с последующей экстракцией фенол/хлороформом [25]. Амплификацию участка ДНК,

содержащего исследуемый полиморфизм, выполняли на приборе фирмы («Perkin Elmer Cetus», США) с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с

использованием последовательностей праймеров (НПО «Вектор») и

соответствующих параметров температурных циклов на программируемом термоциклере фирмы «ДНК-технология» (г. Москва). Рестрикцию продукта амплификации полиморфного варианта -238G/A гена TNF-α проводили эндонуклеазой Msp1 («Сибэнзим», г. Новосибирск), а для полиморфного варианта

-308G/A гена TNF-α эндонуклеазой Bsp19I («Сибэнзим», г. Новосибирск)

76

проводили в течение 12 ч при 37°С. Продукты рестрикции разделяли с помощью электрофореза в 2 %-ном агарозном геле, окрашивали бромистым этидием и визуализировали в УФ-свете на трансиллюминаторе «Macrovue» («Pharmacia LKB», Великобритания), а затем фотографировали в системе видео-гель-

документации («Vilber Lourmat»).

2.2.3 Инструментальные и дополнительные методы исследования Для подтверждения диагноза, оценки стадии заболевания, а также оценки

характера структурных и морфологических изменений проводились ультразвуковое исследование (УЗИ). УЗИ органов брюшной полости проводилось всем пациентам утром натощак после ночного голодания в условиях отделения функциональной диагностики ГКБ 31. Использовался аппарат «Vivid 3» General Electric (США), датчик 5,0 МГц, на который был нанесен специальный гель.

Осмотр печени проводился в положении больного лежа на спине, на левом боку и стоя при задержке дыхания на глубоком вдохе. По данным ультразвукового исследования оценивали размеры печени, структуру паренхимы, наличие и выраженность фиброзных изменений, состояние внутри- и внепеченочных желчных протоков, размеры селезенки, наличие признаков портальной гипертензии (свободная жидкость в брюшной полости расширение воротной и селезеночной вен, наличие венозных анастомозов). Для выявления и оценки степени выраженности портальной гипертензии дополнительно проводили дуплексное сканирование системы воротной вены.

Фиброгастродуоденоскопия (ФГДС) выполнялось пациентам утром натощак после ночного голодания в условиях отделения функциональной диагностики ГКБ 31. Эндоскопическое исследование проводили с помощью эндоскопа

«Olympus GIF Q20» (Япония). В ходе проведения ФГДС оценивали функциональное состояние пищевода, желудка и двенадцатиперстной кишки,

наличие воспалительной реакции гастродуоденальной слизистой оболочки

(портальная гастропатия), исключение эрозивно-язвенных дефектов, нарушения

77

функции кардиального жома и привратника, а также наличие признаков портальной гипертензии (варикозно расширенные вены пищевода и желудка).

При выявлении у исследуемых пациентов клинических признаков сопутствующей аутоиммунной патологии, АИЗП-ассоциированных заболеваний выполнялись дополнительные обследования (определение дополнительных классов аутоантител, исследование гормонов щитовидной железы) с

последующей консультацией ревматолога, гематолога и других соответствующих специалистов.

2.2.4 Пункционная биопсия печени и морфологическое исследование Пункционная биопсия печени с последующим гистологическим и

иммуногистохимическим исследованием проводилась до назначения терапии в условиях ГКБ № 31. Гистологическое исследование выполнено 119 (94,4 %)

пациентам, в том числе 44 (89,8 %) ― с АИГ, 46 (95,8%) ― с ПБЦ и 29 (100 %) ―

с ПБЦ/(АИГ). В связи с наличием гипокоагуляции, являющейся противопоказанием к выполнению пункции печени, семерым пациентам морфологическое исследование печени не проводилось.

Для получения образца ткани печени пункционная биопсия выполнялась иглой Менгини 17G/1,4 мм с использованием набора Hepafix Luer Lock

(B/BRAUN, Германия). Забор биоптата проводился в положении больного на спине. После обработки кожи антисептическим раствором, в IX–X межреберье справа между передней и средней подмышечными линиями выполнялась местная анестезия кожи, подкожной жировой клетчатки и капсулы печени 2 % раствором новокаина. Шприц с набранным изотоническим раствором натрия хлорида вводился в IX–X межреберье. Для постоянной аспирации поршень шприца оттягивался и при задержке дыхания больного на выдохе иглу, расположенную перпендикулярно поверхности кожи, быстрым движением вводили в печень и выводили обратно. Полученный столбик ткани помещался в 10 % раствор формалина. После окончания манипуляции накладывалась стерильная повязка, к

78

месту пункции прикладывался пузырь со льдом. В течение 2 часов больной сохранял постельный режим.

2.2.4.1 Морфологическая оценка биоптатов печени

Гистологическое исследование биоптатов печени проводилось в патологоанатомическом отделении ГКБ № 31 и лаборатории патоморфологии ФГБУ НИИДИ ФМБА России. Иммуногистохимическое исследование препаратов выполнялось в лаборатории патоморфологии ФГБУ НИИДИ ФМБА России.

После 24-часовой фиксации в растворе формалина биоптаты проводили по спиртам возрастающей концентрации и заливали в парафин. Гистологические срезы толщиной 5 мкм окрашивали обзорными гистологическими красителями (гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван-Гизону или трихромом по Массону). Морфологическая оценка материала осуществлялась с использованием светооптического микроскопа Zeiss AxioScope A1, под общим увеличением х400.

Выраженность некровоспалительной активности и определение степени выраженности фиброза (стадии) патологического процесса во всех полученных гистологических препаратах определялись по системе METAVIR [67]

(Таблицы 2.5, 2.6). Возможность использования данной системы для оценки морфологических изменений при аутоиммунных заболеваниях печени протекающих с холестазом, наряду с имеющимися классификациями H. Popper и J. Ludwig, показана в недавней работе К. Л. Райхельсон [22].

79

Таблица 2.5 — Стадии гистологической активности (А) по шкале METAVIR

Примечание: А0 – нет активности, А1 - активность легкая, А2 – активность умеренная, А3 – активность выраженная.

Таблица 2.6 — Стадии фиброза (F) печени по шкале METAVIR

Оценка стадии ПБЦ также проводилась согласно классификации,

предложенной H. Popper и F. Schaffner (таблица 2.7) [261].

Таблица 2.7 — Классификация ПБЦ по H. Popper и F. Schaffner (1970)

80

2.2.4.2Иммуногистохимическое исследование биоптатов

Иммуногистохимические исследования выполнялись в срезах,

изготовленных из парафиновых блоков ткани печени, полученных при пункционной биопсии у 34 пациентов (12 с АИГ, 12 с ПБЦ и 10 с ХГС). Срезы ткани печени толщиной 4–5 мкм помещались на предметные стекла,

предварительно обработанные адгезивом. Иммуногистоморфометрические исследования применялись для количественной оценки экспрессии CD68 и ФНО-

α в непаренхиматозных клетках печени. Высокотемпературная демаскировка антигена в цитратном буфере производилась при постановке реакций с антителами. Использовались мышиные моноклональные антитела к ФНО-α в

разведении 1:100 (DBS, США), к CD 68 в разведении 1:80 (Novocastra Lab,

Великобритания), а также иммуногистохимическая полимерная система визуализации EnVision (DAKO, Германия). Измерения осуществлялись в 15 полях зрения каждого биоптата при увеличении х400 по каждому исследованному маркеру. Оценивались по 5 разных полей из центролобулярных отделов печеночных долек, парабазальных отделов печеночных долек и портальных трактов. Экспрессия CD68 в ткани печени наблюдалась в цитоплазме тканевых макрофагов. Подсчет уровня экспрессии CD68 осуществлялся посредством вычисления среднего показателя абсолютного содержания CD68+ позитивных клеток в изучаемых полях паренхимы печени и стромы портальных трактов.

Экспрессия ФНО-α оценивалась как процент ФНО-α - позитивных клеток от всех непаренхиматозных клеток, экспрессирующих CD68. Изучение иммуногистохимических препаратов осуществлялось с использованием светооптического микроскопа Zeiss AxioScope A1.

2.2.5 Психологическое обследование

Для оценки психоэмоционального состояния пациентов использовались следующие методики определения тревоги и депрессии: интегративный тест тревожности (ИТТ), опросник невротических расстройств симптоматический