2 курс / Гистология / Марченко_Н_В_Клинико_морфологические_и_психоэмоциональные_взаимосвязи

161

патологического процесса в паренхиме печени и худший прогноз в сравнении с

моновариантом ПБЦ [56, 215].

Инфильтрация портальных трактов выявлена во всех образцах ткани печени с ПБЦ/(АИГ) и представлена преимущественно лимфоцитами, эозинофилами с незначительным количеством плазмоцитов. Эти показатели ближе к группе АИГ.

Формирование лимфоидных фолликулов в портальных трактах биоптатов с ПБЦ/(АИГ) определялись чаще, чем при АИГ и ПБЦ, при этом разница с ПБЦ достигала достоверных значений. Подобные данные были получены и в недавнем исследовании К.Л. Райхельсон [22]. Как и в исследовании A.W. Lohse (1999) наши результаты показывают, что обширные ступенчатые некрозы в биоптатах рассматриваемой группы отмечались достоверно чаще, чем при ПБЦ [201].

Перипортальная инфильтрация выявлялась в 86,2 % образцах с ПБЦ/(АИГ),

носила полиморфноклеточный характер, представлена преимущественно лимфоцитами, гистиоцитами и эозинофилами. Интересно, что в образцах ткани печени пациентов с ПБЦ/(АИГ) не было выявлено большого количества плазмоцитов. Наличие гранулем в печеночных дольках было сопоставимо с

группой ПБЦ и встречалось достоверно чаще, чем при моноварианте АИГ. Также

следует отметить, что в биоптатах печени данной группы выявлена наиболее выраженная пролиферация клеток Купфера.

Изменения гепатоцитов, как и при АИГ и ПБЦ, соответствовали преимущественно белковой дистрофии. При данной патологии достоверно реже отмечалась жировая дистрофия гепатоцитов и чаще выявлялись признаки апоптоза гепатоцитов. Это также подтверждает более агрессивное течение ПБЦ/(АИГ).

Поражение как мелких, так и более крупных желчных протоков, альтерация билиарного эпителия отмечались закономерно чаще, чем при моноварианте АИГ.

Кроме того, в образцах данной группы, достоверно чаще, чем при ПБЦ были выявлены такие повреждения билиарного эпителия как наличие внутриэпителиальных лимфоцитов и лимфоцитарная инфильтрация базальной мембраны. Полученные результаты могут быть использованы при

162

дифференциальной диагностике между ПБЦ и ПБЦ/(АИГ). Дуктопения и признаки холестаза отмечались чаще, чем при АИГ, но реже, чем при ПБЦ.

Пролиферация эндотелия артерий в группе ПБЦ/(АИГ) обнаруживалась реже, чем при АИГ и ПБЦ, при этом более часто присутствовала лимфоцитарная инфильтрация в эндотелии артерий. Учитывая наличие лимфоцитов,

инфильтрирующих в эпителий, базальную мембрану желчных протоков, а также эндотелий артерий, можно предположить, что при данном заболевании имеет место наличие дополнительного иммунного клеточно-опосредованного повреждения сосудов в структуре основного процесса.

Полученные в нашем исследовании результаты гистологической оценки биоптатов печени показали некоторую схожесть морфологической картины при всех видах АИЗП, что затрудняет дифференциальную диагностику. При этом был выявлен также ряд отличительных особенностей каждой группы среди других,

которые могут быть использованы клиницистами в трудных дифференциально-

диагностических случаях. Такими особенностями для группы АИГ явились:

отсутствие гранулем, реже встречающееся поражение желчных протоков и альтерации билиарного эпителия, отсутствие апоптоза холангиоцитов. Для ПБЦ – единичные ступенчатые некрозы, наличие холестаза, в том числе внутриклеточного, а для ПБЦ/(АИГ) – лимфоцитарная инфильтрация базальной мембраны желчных протоков.

В нашей работе мы выявили следующие отличительные признаки ПБЦ/(АИГ) от АИГ – наличие гранулем, поражение желчных протоков,

альтерация билиарного эпителия, в том числе дистрофия, апоптоз холангиоцитов

идесквамация эпителия желчных протоков, поражение (разволокнение,

разрушение) базальной мембраны желчных протоков; и от моноварианта ПБЦ – чаще встречающиеся лимфоидные фолликулы в портальном тракте, обширные ступенчатые некрозы. Эти данные согласуются с результатами как отечественных, так и зарубежных авторов [2, 22, 80, 201].

Кроме того, мы получили новые данные, которые можно использовать при дифференциальной диагностики исследуемых заболеваний. Так, нами показано,

163

что отличительными морфологическими признаками ПБЦ/(АИГ) от АИГ являются – чаще выявляемая зернистая дистрофия гепатоцитов и поражение преимущественно крупных желчных протоков, а от ПБЦ – реже выявляемая жировая дистрофия гепатоцитов, а также лимфоцитарная инфильтрация базальной мембраны протоков и внутриэпителиальные лимфоциты. Стоит подчеркнуть, что поражения гепатоцитов, как отличительный морфологический признак, впервые показано в нашем исследовании.

Полученные нами достоверные взаимосвязи отдельных клинико-

лабораторных показателей с морфологическими изменениями могут быть использованы в качестве дополнительных параметров при оценке некровоспалительного процесса в печени при невозможности выполнения пункционной биопсии и гистологического исследования. Установлено, что при АИГ уровень ЩФ ассоциирован с наличием признаков холестаза, а также выявлением лимфоидных фолликулов в портальных трактах. Кроме того, уровень общего билирубина взаимосвязан с пролиферацией желчных протоков, а уровень СОЭ – с пролиферацией желчных протоков и нарушением базальной мембраны протоков. Наиболее интересным в данной связи является показатель уровня СОЭ.

Недавнее исследование К.Л. Райхельсон [22] показало роль определения повышения уровня СОЭ при различных типах патологии печени аутоиммунной природы, но более высокие показатели были характерны для ПБЦ или ПБЦ/(АИГ), чем для АИГ. Таким образом, повышение данного показателя, наряду с ЩФ и общим билирубином, у пациента с АИГ должно настораживать врача в отношении развития сочетанной аутоиммунной патологии печени. Среди клинических проявлений достоверная взаимосвязь с морфологическими признаками при АИГ выявлена для спленомегалии и желтухи. Так, наличие желтухи отображало присутствие лимфоидных фолликулов в портальных трактах,

а также выраженную пролиферацию Купферовских клеток. В нашей работе не было выявлено различий между исследуемыми группами при оценке пролиферации клеток Купфера. Однако этот признак является более характерным

164

для моноварианта ПБЦ. Наличие лимфоидных фолликулов в строме портальных трактов считается отличительным признаком ПБЦ/(АИГ) [2, 22].

Для пациентов с ПБЦ были выявлены следующие клинико-

морфологические взаимосвязи. Отрицательную взаимосвязь между кожным зудом и наличием дуктопении можно объяснить тем, что у пациентов с аутоиммунной патологией печени на поздних стадиях отмечается уменьшение кожного зуда [188, 307], а наличие дуктопении отражает уровень общего билирубина, который также повышается на более поздних стадиях [87, 263].

Также мы выявили, что выраженная гепатомегалия ассоциирована с наличием холестаза, преимущественно внутриклеточного. Данную взаимосвязь необходимо учитывать при оценке состояния пациента, особенно при невозможности оценки лабораторных показателей холестаза. В литературе имеются сведения о взаимосвязи гистологической картины с клинико-лабораторными показателями при ПБЦ. Так, выявлено, что повышение уровня ЩФ ассоциировано с тяжестью дуктопении и некровоспалительной активностью; повышение уровней АСТ, АЛТ и IgG – со степенью перипортального и долькового некровоспаления, а уровень общего билирубина отражает наличие дуктопении и ступенчатых некрозов [87, 263]. Кроме того, описано, что повышение уровней γ-глобулинов, общего билирубина при выявлении гипоальбуминемии и тромбоцитопении являются ранними маркерами развития цирроза печени при ПБЦ [87, 263]. В нашей работе выявлены достоверные взаимосвязи между такими лабораторными показателями как АЛТ, АСТ и ЩФ с признаками холестаза как, в общем, так и капиллярным в частности. Таким образом, повышение уровня сывороточных трансаминаз при ПБЦ не должно вызывать у врача сомнений в диагнозе, а требует коррекции терапии холестаза и дальнейшего наблюдения. Также выявлено, что уровень СОЭ при ПБЦ ассоциирован с расширением портального тракта за счет клеточной инфильтрации, однако, как уже было описано выше, не отражает имеющейся активности некровоспалительного процесса в ткани печени.

Также как и для моноварианта АИГ, для ПБЦ/(АИГ) практически отсутствуют данные по наличию взаимосвязей между клинико-лабораторными и

165

морфологическими показателями. В единичных работах отмечено, что уровень общего билирубина рассматривается как основной прогностический маркер при данной патологии, а наряду с ЩФ является предиктором ответа на комбинированную терапию [30, 95]. Каких-либо непосредственных взаимосвязей с морфологическими признаками не описано. В нашей работе были выявлены следующие ассоциации. Так, уровень АСТ взаимосвязан с расширением портального тракта за счет клеточной инфильтрации, что является морфологическим признаком текущего воспалительного процесса, повреждения гепатоцитов и, соответственно, нарастанию ферментов. Интересной является выявленная достоверная взаимосвязь между уровнями АЛТ, АСТ и общего билирубина и фиброзом центральной вены. Мы впервые описываем данный морфологический признак при аутоиммунном поражении печени, наиболее вероятно указывающий на предшествующий активный воспалительный процесс в центролобулярной зоне. При анализе клинико-морфологических ассоциаций показана отрицательная взаимосвязь кожного зуда с васкуляризацией септ – морфологическим признаком поздних стадий цирроза. Полученная ассоциация также подтверждается тем фактом, что на поздних стадиях аутоиммунных заболеваний протекающих с холестазом, отмечается уменьшение выраженности кожного зуда. Кроме того, установлена взаимосвязь наличия выраженной гепатомегалии с лимфоидными фолликулами в портальных трактах, что можно объяснить более агрессивным воспалением в ткани печени при ПБЦ/(АИГ).

Несмотря на несомненную ценность гистологического исследования,

необходимо помнить, что для постановки окончательного диагноза АИЗП необходимо принимать во внимание совокупность всех результатов исследований

(клинико-лабораторных, иммунологических и гистологических).

166

4.4 Анализ и обсуждение результатов исследования роли фактора некроза опухоли-альфа в патологическом процессе при аутоиммунных заболеваниях

печени (сывороточные показатели, имуногистохимическое и генетическое исследования)

Сцелью оценки роли ФНО-α в развитии аутоиммунных заболеваний печени

врамках нашего исследования было проведено определение сывороточного уровня данного цитокина, оценка полиморфных вариантов гена TNF-α -308 G/A и

-238 G/A, а также определение экспрессии ФНО-α CD68+ макрофагами при иммуногистохимическом исследовании биоптатов печени. Сразу стоит отметить,

что проведенный корреляционный анализ не выявил взаимосвязи между носительством изучаемых полиморфных вариантов гена TNF-α и уровнем экспрессии ни в одной из изучаемых групп.

В нашем исследовании выявлена более частая встречаемость полиморфизма

-308 G/A гена TNF-α у пациентов с АИГ в сравнении с группой контроля,

представленной здоровыми людьми, проживающими на территории Санкт-

Петербурга и Ленинградской области. Наличие данного полиморфизма увеличивало риск развития АИГ в 4,99 раза. Полученные нами данные согласуются с результатами различных исследований, также показавших, что наличие полиморфизма -308 G/A гена TNF-α взаимосвязано с развитием АИГ как у европеоидов [86, 94], так и в китайской популяции [207]. Однако в литературе представлено довольно много результатов исследований, не показавших подобной взаимосвязи [70, 120, 338]. Кроме того, нами было показано, что наличие полиморфизма -308 G/A гена TNF-α у пациентов с АИГ имело отрицательную взаимосвязь с уровнем СОЭ и выявлением ANA. Можно предположить, что носительство данного полиморфного варианта гена будет обусловливать более позднюю диагностику заболевания в связи со стертой лабораторной картиной.

Выявленная в нашем исследовании ассоциация полиморфизма -308 G/A

гена TNF-α с развитием ПБЦ согласуется с результатами работы M.A. Gordon

(1999г) [133], однако противоречит более поздним наблюдениям [82, 268]. Кроме

167

того, в нашем исследовании впервые получены данные о взаимосвязи

носительства полиморфного варианта -238 G/A гена TNF-α и риском развития

ПБЦ/(АИГ).

Влитературе имеются сведения о том, что у пациентов с ПБЦ тяжесть заболевания ассоциировалась с аллелью -308А [308], а аллель -308G – с более поздними стадиями заболевания [168]. Нами установлено, что у пациентов с ПБЦ носительство генотипа -308 G/A взаимосвязано с менее выраженной некровоспалительной активностью заболевания и более высокими цифрами ЩФ.

Ау пациентов с генотипом -238 G/A реже определялся тип свечения MND.

Вкачестве группы сравнения при иммуногистохимическом исследовании и определении сывороточного уровня цитокина были включены пациенты с ХГС.

Это заболевание, также как и АИЗП, сопровождается активным воспалением в ткани печени, при этом часто в крови пациентов выявляется циркуляция различных групп аутоантител. В связи с этим нередко встает вопрос дифференциальной диагностики данных заболеваний. Проведенные исследования доказали роль ФНО-α в развитии ХГС и поддержании патологического процесса

[1, 111].

Имеются единичные работы, в которых было выявлено повышение сывороточного уровня ФНО-α у пациентов с АИГ [112, 211]. Повышение уровня ФНО-α при вирусном гепатите описано у тех пациентов, у которых также обнаруживались циркулирующие аутоантитела в сыворотке крови [1].

Наибольшее количество исследований проведено по определению данного цитокина в сыворотке крови у пациентов с ПБЦ. При этом также получены противоречивые данные. По результатам одних исследователей выявлен повышенный сывороточный уровень ФНО-α [9], а в исследовании M. Yamashiki

уровень данного цитокина в сыворотке крови пациентов с ПБЦ не превышал допустимых значений, при этом были найдены более низкие значения у пациенток старше 30 лет [336]. По данным нашего исследования ни в одной из исследуемых групп с АИЗП (АИГ и ПБЦ), также как и в группе контроля (ХГС)

168

не было выявлено повышения уровня данного цитокина в сыворотке крови выше пороговых значений.

В исследовании K. Streetz и соавт. (2000) [301] на животных моделях и на пациентах установлено, что ФНО-α вовлечен в запуск повреждения паренхимы печени в качестве инициирующего агента и его уровень был выше у пациентов с фульминантной печеночной недостаточностью [37, 38, 66, 151, 228, 235]. В нашем исследовании иммунологический анализ крови на ФНО-α всем пациентам выполнялся на фоне уже текущей, развернутой картины аутоиммунного процесса в печени. Можно предположить, что после запуска аутоиммунного процесса,

концентрация цитокина в крови уменьшается и его действие разворачивается в ткани печени. Наше предположение подтверждается данными исследования,

которое показало что ФНО-α реализует свои свойства паракринными механизмами, т.е. непосредственным воздействием на клетку [40]. В связи с этим,

мы провели оценку экспрессии ФНО-α тканевыми макрофагами непосредственно в ткани печени.

При анализе зарубежной и отечественной литературы не было найдено данных об определении уровня экспрессии ФНО-α тканевыми макрофагами в ткани печени пациентов с АИГ, а при ПБЦ оценка проводилась на криообразцах ткани печени [155, 343]. Мы изучали экспрессию ФНО-α CD68+ макрофагами в ткани печени иммуногистохимическим методом как в группах АИГ, ПБЦ, так и в группе контроля – ХГС. Были оценены абсолютные значения содержания тканевых (CD68-позитивных) и ФНО-α экспрессирующих макрофагов в печеночной ткани, так и экспрессия ФНО-α CD68+ макрофагами печени

(рассчитанная как % ФНО-α позитивных клеток от CD68+ макрофагов печени).

Интересно, что при ХГС отмечалось достоверно большее количество как тканевых макрофагов во всех изучаемых зонах, так и, соответственно, ФНО-α

экспрессирующих макрофагов в сравнении с группами АИГ и ПБЦ. При этом,

оценка абсолютных значений тканевых макрофагов в изучаемых зонах выявила схожее их распределение в биоптатах всех групп – наибольшее количество найдено в зонах портальных трактов. Однако при оценке содержания ФНО-α

169

экспрессирующих макрофагов и экспрессии ФНО-α макрофагами в биоптатах печени изучаемых групп выявлены различия. При ХГС, как в общем, так и по отдельным зонам, отмечено достоверно большее количество тканевых и ФНО-α

экспрессирующих макрофагов в сравнении с соответствующими зонами в биоптатах АИГ и ПБЦ. Наибольшее количество ФНО-α экспрессирующих макрофагов в биоптатах ХГС и соответственно максимальная экспрессия ФНО-α

тканевыми макрофагами обнаружена в центролобулярной зоне. В группах АИГ и ПБЦ наибольшее количество ФНО-α экспрессирующих макрофагов, как и количество тканевых макрофагов в целом выявлено в зоне портальных трактов.

Данное соотношение отмечено и в экспрессии ФНО-α тканевыми макрофагами в группе АИГ. В то время как при ПБЦ зоной максимальной экспрессии ФНО-α

тканевыми макрофагами явилась парабазальная. Уровни экспрессии ФНО-α

тканевыми макрофагами в парабазальной зоне при АИГ и ХГС были сопоставимы.

Несмотря на то, что ХГС, АИГ и ПБЦ имеют характерные отличительные для каждого состояния морфологические признаки, в клинической практике довольно часто приходится сталкиваться с вопросом дифференциальной диагностики между данными нозологическими формами. В практической деятельности клинициста наибольшее значение имеют выявленные различия в экспрессии данного цитокина именно между АИГ и ХГС, как двух патологических процессов, имеющих во многом общие морфологические черты,

часто протекающих с высокой некровоспалительной активностью и нередко вызывающих трудности в дифференциальной диагностике. Также, зачастую трудным является разграничение АИГ и ПБЦ, особенно в дебюте заболеваний. А

от верно установленного диагноза зависит корректное назначение терапии и прогноз пациента. В связи с этим, важное значение имеют установленные достоверные различия в экспрессии ФНО-α в ткани печени. Так выявлены статистически значимые различия (р<0,05) в экспрессии ФНО-α тканевыми макрофагами в центролобулярной зоне между группами АИГ и ПБЦ. Между группами АИГ и ХГС достоверные различия в экспрессии ФНО-α тканевыми

170

макрофагами показаны для парабазальной (р<0,0001) и центролобулярной

(р<0,005) зон.

В литературе нет данных о наличии взаимосвязи уровня экспрессии ФНО-α

тканевыми макрофагами и морфологической картиной при АИЗП. Мы показали взаимосвязь экспрессии изучаемого цитокина тканевыми макрофагами портальной зоны при АИГ с гистологической активностью в ткани печени оцененной по системе METAVIR, а также лабораторным показателем цитолиза – уровнем АСТ. При ПБЦ показана взаимосвязь с нарушением целостности следующих структур ткани печени: уровня экспрессией ФНО-α макрофагами в целом с пролиферацией эндотелия желчных протоков и экспрессией ФНО-α

макрофагами центральной зоны с дискомплексации печеночных балок.

Мы считаем, что с прогрессированием стадии заболевания идет истощение продукции цитокина и его экспрессия снижается. Что косвенно подтверждается полученными отрицательными взаимосвязями экспрессии ФНО-α с уровнем общего билирубина, который является маркером прогрессирования фиброза и жалобами на кожный зуд, интенсивность которого, как известно, уменьшается на более поздних стадиях.

Исследования по изучению механизмов патогенеза АИЗП показали, что при данной патологии отмечается снижение количества регуляторных (Tregs) на фоне активации различных эффекторных (Teffs) клеток [203, 376]. Одним из факторов,

нарушающих данный баланс, рассматривается терапия препаратами анти-ФНО-α.

Имеющиеся в литературе данные об успехах антицитокиновой терапии при АИЗП характеризуются как «парадокс», а инициация аутоиммунного процесса в печени как «темная сторона» анти-ФНО-α терапии [376].

Основываясь на роли ФНО-α в патогенезе АИЗП предполагается несколько вариантов воздействия анти-ФНО-α препаратов:

1 – блокировка ФНО-α на TNFR2 связанных с Teffs клетками приведет к перевесу в сторону активности Tregs клеток и подавлению аутоиммунного процесса. Этим можно объяснить положительное влияние данной терапии на течение АИЗП;