2 курс / Гистология / КОЛИЧЕСТВЕННАЯ_ОЦЕНКА_ИЗМЕНЕНИЙ_В_МИКРОСТРУКТУРЕ_ПЕРИНЕЙРОНАЛЬНЫХ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Перинейрональные сети (PNN) – высокоструктурированный тип внеклеточного матрикса головного и спинного мозга позвоночных животных и человека. Перинейрональные сети покрывают тела и проксимальные дендриты обширных субпопуляций нейронов, в том числе парвальбумин-

экспрессирующих ГАМКэргических интернейронов, участвуют в регуляции пластичности нейронов [1, 2], нейропротекции [3, 4] и в поддержании ионного гомеостаза вокруг высокоактивных нейронов [5, 6, 7]. PNN имеют важное значение в механизмах нейрональной пластичности, памяти, страха, а

также ряда патологий мозга – эпилепсии, шизофрении, болезни Альцгеймера,

инсульта и посттравматического синдрома – патологий, несущих огромную социальную нагрузку на общество. В частности, травма спинного мозга,

изучавшаяся в настоящей работе, несет серьезные социальные последствия по данным Всемирной организации здравоохранения, в том числе снижение продолжительности жизни, психологические расстройства, проблемы в семье, низкую вовлеченность в образование и экономическую деятельность.

Современные представления о формировании и физиологических функциях перинейрональных сетей тесно связаны с концепцией критического периода пластичности головного мозга как фазы онтогенеза, в

которой происходит массовое образование и перестройка синаптических связей в нейронных сетях [8]. Образование перинейрональных сетей является механизмом завершения критического периода пластичности мозга,

поскольку, согласно накопленным на сегодняшний день экспериментальным данным, перинейрональные сети подавляют нейрональную пластичность, т.е.

перестройку синаптических сетей взрослого мозга [9]. Разрушение PNN в

зрелом возрасте приводит к ювенильно-подобному состоянию пластичности,

в котором возможно прорастание аксона [8]. При генетическом удалении компонентов PNN в мозге грызунов в зрелом возрасте сохраняется

5

https://t.me/medicina_free

нейрональная пластичность и появляется аномальная синаптическая передача [10].

Последние исследования свидетельствуют о важной роли PNN в

патофизиологии эпилепсии [11, 12, 13]. Перинейрональные сети разрушаются при эпилепсии матриксными металлопротеиназами [14]. При этом экспериментальное ферментативное расщепление перинейрональных сетей вызывает усиление мышечных судорог в модели эпилепсии крыс, что позволяет предположить защитное антиэпилептическое действие перинейрональных сетей [12]. Более того, перинейрональные сети регулируют свойства возбудимости интернейронов вблизи опухолей,

вызывающих эпилепсию [13].

Перинейрональные сети защищают нейроны от окислительного стресса в генетически модифицированных мышах с эндогенной антиоксидантной системой, ослабленной вследствии нарушения экспрессии регуляторной субъединицы глутамат-цистеин лигазы [14]. Эти данные позволяют предположить, что перинейрональные сети защищают нейроны от клеточной смерти, вызванной токсичным эффектом гиперактивности возбуждающих глутаматэргических нейронов и, как следствие, нарушения баланса возбуждение-торможение при эпилепсии [11, 12, 13]. В то же время,

перинейрональные сети сами подвержены разрушению вследствие окислительного стресса, что является одним из предполагаемых молекулярно-клеточных механизмов шизофрении [14].

В данной работе проведены одни из первых в мире количественных исследований микроструктуры ячеек перинейрональной сети за всю историю изучения этого типа внеклеточного матрикса (см. ссылка 43 в [15]), которые могут лечь в основу моделей PNN и методов выявления патологий,

приводящих к структурным изменениям в перинейрональных сетях.

Термином микроструктура принято обозначать структуру,

исследованную методами световой микроскопии.

6

https://t.me/medicina_free

Цель настоящей работы - количественная оценка изменений в микроструктуре перинейрональных сетей и их комплексов с синапсами коры полушарий головного мозга мыши, крысы; спинного мозга мыши в экспериментальных физиологических и патологических условиях методами эпифлуоресцентной и конфокальной микроскопии.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1) Разработка полуавтоматического метода количественного анализа микроструктуры PNN по данным эпифлуоресцентной микроскопии головного и спинного мозга. Анализ количественный изменений структуры

PNN в постнатальном развитии коры головного мозга мыши, а также при травме спинного мозга мыши.

2)Разработка комплексного полуавтоматического метода для анализа микроструктуры PNN по данным конфокальной микроскопии высокого разрешения, включающего алгоритм автоматического определения контура ячейки.

3)Разработка количественного метода анализа трёхмерной геометрии комплекса PNN и синапсов по данным конфокальной микроскопии высокого разрешения. Количественное исследование микроструктуры комплекса PNN

исинапсов соматосенсорной коры головного мозга мыши в модели сенсорной депривации.

4)Сравнительный анализ разработанных нами методов (ручного и полуавтоматического обведения ячеек PNN) по применимости для количественного анализа микроструктуры PNN по данным конфокальной микроскопии.

Объекты исследования

Перинейрональные сети в соматосенсорных областях коры полушарий головного мозга мыши и крысы, а также их комплексы с ГАМКергическими синапсами; перинейрональные сети в шейном отделе спинного мозга мыши.

7

https://t.me/medicina_free

Методы исследования

Для выполнения указанных задач проводилась эпифлуоресцентная микроскопия на микроскопе Zeiss Axio Imager 2.0 с цифровой камерой Zeiss AxioCam HRc, расположенном в Центре Нейронаук Университета Хельсинки. Объективы Plan-Apochromat 20х/0.8 (размер пикселя 510 нм) и 10х/0.6 (размер пикселя 645 нм).

Конфокальная микроскопия проводилась на микроскопах:

1)Zeiss LSM 780, объектив Plan-Apochromat 63х/1.40 Oil DIC M27,

расположенном в междисциплинарном центре «Аналитическая Микроскопия» Казанского Федерального Университета. Размер

вокселя 100x100x200 нм.

2)Zeiss LSM 710, объектив Plan-Apochromat 40x/1.4,

расположенном в Центре Нейронаук Университета Хельсинки. Размер вокселя 300х300х300 нм.

3) Zeiss LSM 700, объектив EC Plan-Neofluar 20х/0,50 M27 и PlanApochromat 63×/1.40 oil M27, расположенном в Магдебургском филиале Германского Центра Изучения Нейрозаболеваний. Размер вокселя 100x100x200 нм.

В качестве маркера PNN использовался агглютинин Wisteria Floribunda (WFA), связанный с флуорофором Alexa Fluor 633, поскольку WFA

связывается с N-ацетилгалактозамином (GalNAc) в цепях хондроитин сульфатов (ХС). Для окрашивания нейрональных и синаптических маркеров использовалась иммуногистохимия - наборы из первичных и вторичных антител, связанных с метками-флуорофорами, обычно Alexa Fluor 488.

Анализ полученных изображений проводился программными пакетами

FIJI и Imaris (Bitplane).

Научная новизна

Впервые в мире проведен количественный анализ микроструктуры ячеек PNN. Впервые установлены изменения количественных параметров

8

https://t.me/medicina_free

микроструктуры PNN: 1) в посттравматическом спинном мозге мышей

(шейный отдел) в зависимости от расстояния от травмы; 2) в медиальной префронтальной коре крыс в кетаминовой модели шизофрении; 3) в

комплексе с ГАМКергическими синапсами соматосенсорной коры мыши при неонатальной сенсорной депривации.

Научная и практическая ценность.

Научную ценность представляют данные количественных изменений микроструктуры PNN в норме и двух моделях патологии, которые следует рассматривать как первый и необходимый этап изучения связи их структуры и функций, в том числе влияния структуры PNN на работу ГАМКергических синапсов на поверхности нейронов в ЦНС и регуляцию нейропластичности.

Научно-практическая значимость состоит в разработанных новых методах анализа микросктруктуры. Поскольку перинейрональные сети могут рассматриваться как новый биомаркер и объект фармакологического воздействия, понимание механизмов работы PNN может лечь в основу разработки методов диагностики и терапии заболеваний, связанных с нарушением их функционирования.

На защиту выносятся следующие положения:

1)Разработан набор методов количественного анализа микроструктуры

PNN по данным эпифлуоресцентной и конфокальной микроскопии;

2)Данные по изменению микроструктуры ячеек PNN (снижение средней толщины ячейки) и ГАМКергических пресинаптических терминалей

(снижение объема VGAT-положительных объектов) в бочонковой коре мыши в экспериментальной модели соматосенсорной депривации.

Личный вклад автора

Разработка методов ручного и полуавтоматического анализа

микроструктуры PNN в изображениях с низким и высоким разрешением.

9

https://t.me/medicina_free

Разработка метода анализа трёхмерной геометрии комплекса PNN и

синапсов. Разработка скриптов (программного кода) для проведения анализа данных микроскопии. Участие в обработке полученных результатов экспериментов, их анализ и интерпретация. Написание статей (автор и соавтор) по теме исследования и представление результатов на различных российских и международных конференциях.

Апробация работы

Основные результаты работы были доложены на следующих научных школах и конференциях: «Трансляционная медицина 2016» (г. Казань,

Россия, 13-14.10.2016); «8 Annual Meeting of the Nordic EMBL partnership for molecular medicine» (г. Хельсинки, Финляндия, 4-7.09.2017); «Danish Bioimaging meeting 2018» (г. Оденс, Дания, 2.10.2018); «Neuroscience Day. Brain Jam» (г. Орхус, Дания, 13.05.2019); «22nd EMBL PhD Symposium «The Roaring 20s»» (г. Гейдельберг, Германия, 27-28.11.2020); «Актуальные проблемы нейробиологиии», сателлитный симпозиум «От нейрона к мозгу»

(Казань, 9-12.09.2019); Виртуальная конференция «Ломоносов 2020» (г.

Москва, Россия, 2020); «Самойловские чтения. Современные проблемы нейрофизиологии» (г. Казань, Россия, 27.02.2021); «Алмазовский Молодёжный Медицинский Форум - 2021», (г. Санкт-Петербург, Россия, 1215.05.2021); «XVI Международная / XXV Всероссийская Пироговская научная медицинская конференция студентов и молодых ученых» (г. Москва,

Россия, 18.03.2021); «Итоговая общеуниверситетская научная конференция КФУ за 2019 год» (г. Казань, Россия, 2020); «Итоговая общеуниверситетская научная конференция КФУ за 2020 год» (г. Казань, Россия, 2021); «Итоговая общеуниверситетская научная конференция КФУ за 2021 год» (г. Казань,

Россия, 2022); «Итоговая общеуниверситетская научная конференция КФУ за

2022 год» (г. Казань, Россия, 2023).

Работа на отдельных этапах поддерживалась средствами Германской Службы Академических Обменов (DAAD) в рамках программы «Научно-

10

https://t.me/medicina_free