2 курс / Гистология / КОЛИЧЕСТВЕННАЯ_ОЦЕНКА_ИЗМЕНЕНИЙ_В_МИКРОСТРУКТУРЕ_ПЕРИНЕЙРОНАЛЬНЫХ

Мы дополнительно расширили трехмерный анализ геометрии комплекса PNN + синапс, проанализировав распределение интенсивности окрашивания холдроитин сульфатом по оси Z и периметру ячейки. Этот тип анализа позволил нам измерить относительное распределение сигналов

VGAT и ХС по координате Z. На рис. 31 показаны средние значения среднеквадратичного отклонения (RMSD) для положения Z максимальной средней интенсивности ХС-сигнала по периметру ячейки до положения Z - 1)

максимум площади, 2) максимум средней интенсивности, 3) медиана -

трехмерного распределения сигнала VGAT при соматосенсорной депривации по сравнению с контролем. Максимум интенсивности ХС в пределах периметра ячейки и максимум площади VGAT внутри синаптической терминали сдвинуты относительно друг друга по координате Z при соматосенсорной депривации по сравнению с контролем.

Чтобы подтвердить наши результаты уплощения ячеек PNN и

уменьшения объема кластера VGAT, вызванного сенсорной депривацией, мы использовали альтернативный подход к количественной оценке трехмерной геометрии PNN путем анализа поперечных срезов поверхности нейронных клеток, покрытых PNN. Поскольку разрешение XY конфокальной микроскопии значительно выше, чем разрешение по оси Z, одно из преимуществ этого подхода состоит в том, что боковая проекция ячейки ориентирована в конфокальной плоскости (плоскость XY), а не по оси Z, что приводит к более высокому пространственному разрешению изображения.

Мы выполнили трехмерный анализ, аналогичный тому, что мы сделали на ячейках, ориентированных вдоль конфокальной плоскости, и подтвердили уменьшение среднего объема кластера VGAT при соматосенсорной депривации по сравнению с контролем. Затем мы выполнили сегментацию внутриклеточного и внеклеточного пространства, прилегающего к ХС-

положительным объектам ячейки, и обнаружили, что ширина («толщина»)

оболочки ХС, окружающей VGAT-положительные синапсы, уменьшается при соматосенсорной депривации по сравнению с контролем.

81

https://t.me/medicina_free

свидетельство функциональной важности поднимает вопрос о структурном механизме функции PNN. Тем не менее, количественные исследования микроструктуры PNN до недавнего времени отсутствовали [15, 142А, 163А, 174]. Таким образом, наши результаты, описанные в настоящей работе,

представляют собой начало структурных исследований механизмов регуляции синаптической передачи и нейрональной пластичности перинейрональными сетями.

Функциональным признаком постнатального развития коры головного мозга от незрелого до зрелого состояния является резкое снижение нейрональной пластичности, и было систематически показано, что перинейрональные сети играют важную роль в этом переключении в процессе развития [2]. Изменения экспрессии ХСПГ в постнатальном развитии ранее особенно подробно изучались в зрительной коре головного мозга. Отдельные эпитопы ХСПГ как в части ХС, так и в белке обнаруживают зависимую от активности экспрессию в зрительной коре головного мозга при закрытии критического периода в модели депривации зрительного сигнала в постнатальном онтогенезе кошки [108]. Сходное уменьшение эпитопов ХСПГ было зарегистрировано в ядре латерального коленчатого тела кошки при зрительной депривации в постнатальном онтогенезе [179, 180, 181, 182].

В IV слое коры головногомозга перинейрональные сети формируются в конце критического периода пластичности. Соответственно, значительная часть процессов пластичности нейронов завершается к концу первого постнатального месяца в коре головного мозга мышей [183, 184].

Ранее мы предположили, что пространственная структура перинейрональной сети, окружающей синаптический бутон, должна играть важную роль в физиологии синапсов [142А], основываясь на экспериментальных данных, демонстрирующих, что ХСПГ связывает внеклеточный Ca2+ и ряд сигнальных лигандов, включая плейотрофин,

VEGF, GDNF [92, 185]. Первоначальной целью настоящего исследования

83

https://t.me/medicina_free

было изучение микроструктуры синаптических терминалей внутри ячеек

PNN в нормальном развитии и в условиях соматосенсорной депривации. Мы также хотели найти корреляцию между параметрами геометрии синаптической терминали и окружающей ячейки PNN, чтобы понять интегральную архитектуру комплекса синапс + PNN как функционально единого целого. С этой целью мы разработали «синтетический» алгоритм автопороговой обработки для измерения параметров пространственного распределения транспортера VGAT GABA внутри синаптической терминали,

окруженной ячейкой PNN. Этот подход является расширением нашей предыдущей процедуры с использованием 16 различных алгоритмов автоматического определения порога, предоставленных FIJI [145A]. С

помощью этого метода мы стремимся к автоматической и беспристрастной процедуре сегментации изображения, извлекая как можно более точную структурную информацию из конфокальных изображений ткани мозга.

Количественное распределение VGAT внутри ГАМКергических синаптических окончаний остается малоизученным. В своем новаторском исследовании ультраструктуры синапсов мозжечка Чаундри и соавторы продемонстрировали, что VGAT колокализуется с синаптическими пузырьками и отсутствует в других компартментах синаптической терминали

[186].

Эти данные позволяют предположить, что сигнал VGAT, наблюдаемый в нашем исследовании, соответствует распределению везикул с нейромедиатором рядом с активными зонами ГАМКергических синапсов.

Продемонстрированное нами уменьшение размера кластера иммунофлуоресценции VGAT в результате соматосенсорной депривации

(рис. 1, 2, 4) приводит к выводу, что сенсорный ввод необходим для правильного формирования геометрии синапса во время развития, а точнее -

в критический период синаптической пластичности коры головного мозга мышей в течение первого постнатального месяца. Обрезка усов у новорожденных мышей вызывает снижение экспрессии мРНК аггрекана и

84

https://t.me/medicina_free

иммунореактивности Cat-315 в бочонковой коре головного мозга [187].

Рассмотренные в совокупности результаты [187] и наши результаты демонстрируют, что соматосенсорная депривация вызывает изменения как в молекулярном составе, так и в трехмерной структуре перинейрональной сети. Возможные причинно-следственные связи между этими эффектами еще предстоит исследовать.

Ранее мы проанализировали трехмерную пространственную структуру

PNN с помощью инструмента autodepth filament программы Imaris [142А].

Здесь мы расширяем репертуар анализа, измеряя распределение эпитопа ХС по периметру ячейки также в направлении Z. Это дает количественную оценку ширины ячейки и кривизны по оси Z. Более того, этот подход позволяет нам рассчитать положение Z с наивысшей средней интенсивностью сигнала ХС, которое будет использоваться в качестве «0-

координаты» геометрии ячейки для количественной оценки относительных положений VGAT-положительных объектов в комплексе синапс + PNN. 2D-

площадь и 3D-объем VGAT-положительных объектов можно рассматривать как характеристики размера пула синаптических везикул. Это важный параметр для синаптической функции, и поэтому наши количественные исследования микроструктуры и распределения VGAT-положительных объектов должны пролить свет на структурную и функциональную связь между синапсом и окружающей PNN.

Представленный здесь подход к количественным структурным исследованиям и результаты измерений трехмерной структуры комплекса синаптической терминали + PNN способствуют пониманию координации между ВКМ и синаптической сетью, а также молекулярно-физиологических механизмов, соединяющих эти два компонента мозга в единую структурную и функциональную единицу.

85

https://t.me/medicina_free

3.3. Сравнительный анализ новых методов количественного

исследования микроструктуры PNN.

Наши исследования микроструктуры PNN по данным конфокальной микроскопии высокого разрешения начались с разработки компьютерной процедуры (набора макросов) обведения ячеек PNN, при которой исследователь вручную отмечает вершины ячейки инструментом PointPicker [142А]. В целях дальнейшего усовершенствования метода профессором А.

Дитятевым (Германский Центр Нейродегенеративных Заболеваний) была предложена идея полуавтоматической процедуры обведения ячеек PNN.

Совместный проект был выполнен при поддержке Германской Службы Академических Обменов (стипендия Н.С. Липачеву в 2016 г.). Нами была разработана полуавтоматическая процедура обведения PNN, при которой координаты границы ячейки определяются автоматически на основе изменения интенсивности сигнала в радиальном направлении от центра ячейки на конфокальном изображении, где центр ячейки выбирается вручную. Данный метод был использован нами для анализа микроструктуры

PNN в кетаминовой модели шизофрении крыс [163А]. Для дальнейшего совершенствования метода количественного исследования микроструктуры

PNN мы провели сравнительный анализ двух методов [188А].

3.3.1. Ручное обведение.

Впервые мы применили метод ручного обведения микроскопических изображений в работе [142А]. Для этого было использовано свободное ПО

FIJI и его плагин PointPicker. Оператору требуется последовательно отметить вершины ячейки PNN на изображении (рис. 32А), после чего экспортировать их координаты в отдельный файл, из которого их считывают скрипты для анализа. Это позволило проанализировать двумерную геометрию ячеек PNN,

а также распределение окрашивания вдоль их границ.

86

https://t.me/medicina_free

Процедура аннотации координат вершин ячейки исследователем в рамках описываемого метода позволила нам проанализировать соотношение яркости флуоресцентного сигнала покраски на ХСПГ в вершинах и гранях ячеек PNN.

1 мкм

Рисунок 32. Пример ручного выбора ячеек PNN. А – Выбранные вершины ячеек.

Б – Обведённые ячейки, [142А]

Рис. 33. Распределение площадей ячеек у мышей и крыс, [142А]

Отдельные ячейки имели четкие закономерности распределения интенсивности WFA по периметру ячейки. Один из вариантов

87

https://t.me/medicina_free

характеризуется неравномерным распределением сигнала WFA, с большей интенсивностью окрашивания в вершинах и меньшей - в середине ребер (рис.

34). Мы назвали этот тип ячеек полярными. Другой тип имеет относительно равномерное распределение интенсивности окрашивания WFA по периметру ячеек (рис. 35). Мы обозначили его как неполярный.

Рис. 34. Изменения интенсивности вдоль периметра ячейки полярного типа, [142А]

Рис. 35. Изменения интенсивности вдоль периметра ячейки неполярного типа, [142А]

88

https://t.me/medicina_free

Далее мы продемонстрировали, что полярные и

неполярные ячейки расположены не в случайном порядке, а кластерами на поверхности тел нейронов и высказали некоторые предположения о функциональном значении такой кластеризации [144А].

Рис. 36. Распределение индекса полярности у мышей и крыс, [142А]

3.3.2. Полуавтоматическое обведение. Принцип работы.

Перед началом работы скрипта оператор задаёт ряд параметров:

1)R - радиус окружности, обводимой вокруг центра ячейки.

2)S - количество секторов, на которое делится описываемый вокруг центра круг.

3)P - процент для поиска порога интенсивности для поиска внутренней границы ячейки.

4)T - или величина, прибавляемая к интенсивности фона для поиска

89

https://t.me/medicina_free

внутренней границы ячейки.

5) L - количество шагов в процедуре проверки внешней границы ячейки.

На первом этапе оператор выбирает центр ячейки. Вокруг центра обводится окружность радиусом R, после чего из центра выходят отрезки,

которые делят этот круг на равные сектора (рис. 37). Затем анализируется интенсивность пикселей изображения вдоль этих отрезков в направлении от центра.

Рис. 37. Задание центра ячейки и отрезков для анализа.

Первой определяется внутренняя граница объекта (рис. 38). Для этого предварительно необходимо найти порог интенсивности сигнала WFA – как только сигнал будет выше него, то скрипт считает, что мы покинули пустоту в центре ячейки. Порог определяется либо как заданный процент P от интенсивности фона изображения (который, в свою очередь, считается как средняя интенсивность в радиусе одного пикселя вокруг центра), либо как интенсивность фона, к которой прибавлена заданная величина T. После нахождения внутренней границы скрипт начинает поиск внешней границы ячейки. Для этого он сравнивает интенсивности последующих пикселей,

отбирая наибольшую, после которой яркость начинает снижаться (рис. 39).

90

https://t.me/medicina_free