2 курс / Гистология / КОЛИЧЕСТВЕННАЯ_ОЦЕНКА_ИЗМЕНЕНИЙ_В_МИКРОСТРУКТУРЕ_ПЕРИНЕЙРОНАЛЬНЫХ
.pdf
Рис. 38. Пример профиля интенсивности сигнала WFA вдоль отрезка. Фиолетовая метка – внутренняя граница ячейки (интенсивность стала выше порога), зелёная – внешняя граница (интенсивность достигла пика).
После того, как внешняя граница найдена, скрипт продолжает двигаться вдоль отрезка L шагов для проверки. Если на этом этапе был найден пиксель с большей интенсивностью, то за внешнюю границу принимается этот пиксель и проверка повторяется. После того, как эти действия были произведены для всех направлений, мы получаем набор координат вершин ячейки (рис. 39).
А |
Б |
Рис. 39. А - Определение внешней граница ячейки. Б – итоговый контур.
Полуавтоматический скрипт обладает двумя заметными преимуществами перед ручным обведением. Во-первых, оператору нужно тратить меньше времени на задание отдельной ячейки для анализа,
поскольку требуется отметить лишь центр, а не все вершины ячейки. Во-
91
https://t.me/medicina_free
вторых, использование автоматики позволяет устранить субъективность при
выборе границ ячеек.
3.3.3. Проблемы и ограничения полуавтоматического обведения.
1. Оператор способен выбрать любое количество вершин, которое посчитает необходимым для описания границ ячейки. Скрипт же всегда ищет заранее заданное количество. Хотя обычно увеличение числа направлений поиска позволяет точнее определить границы, есть ситуации, в которых это может затруднить анализ. В первую очередь, это влияет на время проведения расчётов. Ещё одним из ограничений алгоритма является то, что он будет определять вершины ячейки только в пределах отрезков, исходящих из центра, в то время как оператор может искать их в любом месте. Поскольку нет гарантий надёжного определения границ ячейки в конкретном отрезке, увеличение числа направлений для поиска может приводить к тому, что скрипт будет чаще задействовать процедуру экстраполяции (задание предполагаемых координат границы на основе известных), сильнее искажая результаты.
Процедура экстраполяции используется тогда, когда на каком-то отрезке не удаётся найти границу или обнаружено, что в каком-то отрезке расстояние от центра до границы заметно больше или меньше соседних отрезков. Например, если на отрезке №2 внешняя граница была найдена на расстоянии 15 пикселей, а на отрезках №1 и №3 – 5 пикселей. При построении контура подобные ситуации выглядят как «шип» (рис. 40). Если имеется слишком много отрезков, на которых не могут быть достоверно найдены границы, ячейка считается нечетко определенной и исключается из анализа.
92
https://t.me/medicina_free
Рис. 40. Пример «шипа», вызванного разрывом в контуре.
2. Из-за неравномерностей в окрашивании ткани, что для оптимального поиска внутренней границы в разных частях образца могут потребоваться разные параметры. От корректного определения внутренней границы, в свою очередь, зависит, не начнётся ли поиск внешней границы слишком рано.
Рис. 41. Пример профиля интенсивности вдоль отрезка. Фиолетовая метка – внутренняя
граница ячейки, зелёная – внешняя. Пример недостаточно высокого порога.
3. После того, как скрипт находит внешнюю границу ячейки, он продолжает двигаться вдоль отрезка на заданное расстояние, чтобы убедиться, что далее нет пикселя с ещё большей интенсивностью. Если это расстояние слишком малое, то небольшое падение интенсивности сигнала может остановить скрипт раньше настоящей границы. Если слишком большое, то он может не остановиться вовремя и за границу может быть принята часть соседней ячейки.
93
https://t.me/medicina_free
А
Б
Рис. 42. Пример профиля интенсивности вдоль отрезка. А. Фиолетовая метка – внешняя граница, определённая оператором, зелёная – граница, определённая скриптом. Б. Зеленая метка – внешняя граница, определённая оператором, фиолетовая – граница, определённая скриптом.
3.3.4. Сравнительный анализ ручного и полуавтоматического
методов обведения ячеек.
Для удобства изложения далее в тексте ручной метод обведения ячеек обозначается «М1», а полуавтоматический метод обведения обозначается
«М2».
Сравнение площадей и периметров ячеек.
В первую очередь, мы сравнили площади и периметры ячеек,
полученных ручным и полуавтоматическим обведениями, в двумерном пространстве конфокальной плоскости. В среднем полуавтоматическое обведение дает большие значения площади ячейки, чем ручное (Рис. 43).
94
https://t.me/medicina_free
Рис. 43. А - средняя площадь; Б - периметр ячеек перинейрональной сети, полученные
путем ручного и полуавтоматического обведения, [188А]
В некоторых случаях это, возможно, объясняется тем, что ячейка нечетко либо не полностью очерчена. Была обнаружена высокая корреляция между значениями площади и периметра контуров, полученных двумя методами
(Рис. 44).
95
https://t.me/medicina_free
Рис. 44. Корреляция значений площади (А) и периметра (Б) ячеек, полученных двумя методами. Прямой линией показана линейная регрессия, R - коэффициент корреляции.
Пунктирная линия под углом 450 показана для анализа отклонения в сторону больших значений, что графически демонстрирует, насколько чаще метод М2 даёт большие значения исследуемого параметра, чем М1, [188А]
Сравнение количественных параметров формы ячеек на конфокальной плоскости.
Для большой части ячеек контуры, полученные ручным и полуавтоматическим обведениями, заметно отличаются друг от друга по форме (Рис. 45).
96
https://t.me/medicina_free
Рис. 45. Пример контуров ячеек PNN на конфокальной плоскости, полученных ручным
(выделено фиолетовым цветом) и полуавтоматическим (голубым) обведениями, [188А]
Для количественного анализа формы ячеек PNN использовались
следующие параметры:
1)Округлость (Circularity) - описывает, насколько ячейка приближается к форме круга. Значение «0» означает вытянутую фигуру, в то время как «1» – идеальный круг.
2)Соотношение сторон (Aspect ratio) - соотношение большой и малой осей овала, внутрь которого вписывается ячейка.
3)Цельность (Solidity) – соотношение площади ячейки к площади многоугольника, который можно описать вокруг ячейки. Чем ближе это число к 1, тем меньше вогнутостей имеет ячейка.
Анализ количественных параметров, характеризующих форму ячейки в проекции конфокальной плоскости, показал отсутствие корреляции между значениями, полученными методами ручным и полуавтоматическим методами обведения (Рис. 46).
97
https://t.me/medicina_free
Рис. 46. Иллюстрация отсутствия корреляции значений параметров, характеризующих
форму ячейки, полученных ручным и полуавтоматическим методами, [188А]
Интенсивность флуоресценции.
Наши результаты показывают высокую корреляцию между значениями для параметров интенсивности флуоресценции покраски хондроитин сульфатов - средней интенсивности контура ячейки (Рис. 47А) и средней интенсивности всех пикселей ячейки (Рис. 47Б).
98
https://t.me/medicina_free
Рис. 47. Иллюстрация корреляции значений интенсивности пикселей, принадлежащих контуру (А) и всех пикселей ячейки (Б), полученных двумя методами. Пунктирная линия под углом 450 показана для анализа отклонения в сторону больших значений, что графически демонстрирует, насколько чаще метод М2 даёт большие значения исследуемого параметра, чем М1, [188А]
Толщина ячейки вдоль оси Z.
Для сравнения значений толщины ячеек по контурам, полученных ручным и полуавтоматическим обведениями, был использован тот же подход, что и в работе [172А] (Рис. 48). Средние величины толщины, полученные двумя методами (ручным и полуавтоматическим), хорошо согласуются между собой (Рис. 49А), гистограммы разности значений показывают небольшие расхождения результатов измерений двумя методами для отдельных ячеек
(Рис. 49В). Также наблюдается высокая корреляция между значениями толщины ячейки (Рис. 49Б).
99
https://t.me/medicina_free
Рис. 48. Анализ толщины ячейки на поверхности нейрона вдоль оси Z конфокального стака. (А-Б) - анализируемая ячейка; (В-Г) - карты интенсивности флуоресценции вдоль контура ячейки в конфокальном стаке, построенные для контуров ручного (В) и
полуавтоматического обведений (Г). Желтыми линиями отмечена конфокальная плоскость с наибольшей средней интенсивностью. Зелеными линиями отмечены верхние и нижние границы ячейки, определенные на основе порога интенсивности, [188А]
100
https://t.me/medicina_free