2 курс / Гистология / КОЛИЧЕСТВЕННАЯ_ОЦЕНКА_ИЗМЕНЕНИЙ_В_МИКРОСТРУКТУРЕ_ПЕРИНЕЙРОНАЛЬНЫХ

Глава 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ PNN

Одним из основных методов исследования внеклеточного матрикса (в

том числе PNN) является микроскопия. Появление красителей, специфичных к определенным веществам в клетке, сделало возможным качественный и простой количественный анализ изображений. Следующим шагом в развитии микроскопии стало появление средств эффективной фиксации полученных изображений. Они дают возможность получить информацию о структуре объекта в удобном для анализа цифровом формате за короткий промежуток времени. Современные компьютерные программы для анализа изображений позволяют производить высокоточные количественные измерения, что делает метод микроскопии особенно информативным при исследовании

PNN.

2.1. Микроскопы для исследований в проходящем свете

Первые микроскопы для биологических исследований работали в проходящем свете (рис. 4). Это самый распространенный вид микроскопа и в настоящее время. Основными его элементами являются:

1)Объектив, который представляет собой систему линз. Фронтальная линза – та, что расположена ближе всего к объекту. Свет, который проходит через них, преломляется (7′) и в результате получается перевернутое и увеличенное изображение объекта. Если разместить действительное изображение за передним фокусом окуляра получится

мнимое изображение 7′′. Впоследствии на сетчатке глаза наблюдателя

изображение объекта.

2)Осветитель состоит из лампы и линзы-коллектора. Он дает свет системе.

3)Конденсор представляет собой систему линз. Его задача – направлять свет на объект. Чтобы изменить форму и размеры освещенного участка

объекта нужно изменить полевую диафрагму осветителя.

31

https://t.me/medicina_free

Длина волны λ используемого света и численная апертура объектива

NA определяют минимальное расстояние d = 0.61*λ/NA между двумя светящимися точками, различимыми на изображении. Эта величина называется разрешающей способностью микроскопа.

Численную апертуру микроскопа можно рассчитать по формуле NA = n*sin(α), где α — угловая апертура объектива (угол между крайними лучами пучка света, входящего в объектив, и оптической осью), n — показатель преломления среды между объектом и фронтальной линзой объектива. Из-за эффекта полного внутреннего отражения величина NA в воздушной среде не превышает 0.95. Чтобы увеличить разрешающую способность микроскопа пространство между препаратом и фронтальной линзой заполняют иммерсионной жидкостью с показателем преломления выше, чем у воздуха

(вода, глицерин). Такие микроскопы называются иммерсионными.

Исследования на живых клетках и тканях имеют несколько основных направлений, например, выведение хирургическим путем наружу какой-либо ткани и ее изучение, вживление прозрачной камеры в череп подопытного животного для наблюдения нейронов и их окружения, помещение выделенных клеток или тканей в сосуд со специальной питательной средой

(в этом случае наблюдения ведутся через дно сосуда).

Для преодоления проблемы прозрачности структур живых клеток в видимом свете можно использовать фазово-контрастный,

интерференционный и поляризационный микроскопы, а также ультрафиолетовый свет. Одним из распространенных способов преодоления этого ограничения является окрашивание клеток безвредными специально подобранными веществами.

Еще одна проблема микроскопии органов и тканей живых организмов

– их толщина и непрозрачность. Решается она с помощью использования опак-иллюминаторов – осветителей отраженного света (рис. 5) –

устанавливаемых между объективом и окуляром микроскопа.

33

https://t.me/medicina_free

релаксационных процессов. При помощи определённых методов (например,

иммуногистохимических) можно окрашивать только определенные структуры. Благодаря этому можно получать изображения с высоким контрастом, поскольку фон будет темнее объектов.

Рисунок 6. Принципиальная схема флуоресцентного микроскопа, работающего в отраженном свете. Заимствовано из Мухитов А., Архипова С., «Методы световой микроскопии для биологических и медицинских исследований» [126]

В 1948 г. был создан опак-иллюминатор [127], позволяющий возбуждать фотолюминесценцию исследуемых объектов через объектив микроскопа. Это было достигнуто использованием дихроичного

(двухцветного) зеркала вместо полупрозрачного на месте светоделительной пластинки. В этом случае одновременно отражается в сторону объектива

35

https://t.me/medicina_free

возбуждающее излучение и пропускается к окуляру излучение от объекта.

Это основной принцип работы большинства современных микроскопов.

Потери энергии при флуоресценции можно описать следующим образом. Рассмотрим 2 энергетических уровня молеклы или иона – основной

(Е0) и первый возбужденный (Е1) (рис. 7). Каждый из них имеет набор колебательных (сходящихся) подуровней с колебательными квантовыми числами v'' = 0, 1, 2, ... v''max и v' = 0, 1, 2, ... v'max для основного и первого возбужденного состояний.

Рисунок 7. Энергетическая диаграмма Яблонского. Заимствовано из Стрыгин А. В.

«Флуоресценция в биомедицинских исследованиях. Учебное пособие» (2020) [128]

Флуорофоры, применяемые в биологических и медицинских исследованиях, обычно являются растворами. Взаимодействия с окружающими частицами подавляет их вращение, и поэтому вращательные подуровни не учитываются. При обычных температурах молекулы и ионы находятся в невозбужденном состоянии (v'' = 0). Квант возбуждения имеет энергию Еabc = h*vabc, где h – постоянная Планка, vabc – частота поглощенного света. При поглощении частицей кванта света она увеличивает свою энергию

(возбуждается) и переходит в верхнее электронно-колебательное состояние Е1 – на некоторый колебательный уровень с колебательным квантовым числом v', то есть осуществляется энергетический переход v'' → v'.

36

https://t.me/medicina_free

В возбужденном состоянии флуорофор проводит очень мало времени

(для органических веществ это число порядка 10-9–10-8 с). Потеря энергии происходит быстро и по-разному:

1.Излучение всей поглощенной энергии разом в виде кванта света и возвращение в основное состояние.

2.Безизлучательная потеря части энергии (самый простой вариант -

при столкновении с другими частицами, когда происходит тепловой обмен),

при которой флуорофор перейдет из возбужденного колебательного состояния с v ≠ 0 на низший колебательный уровень v' = 0 электронного состояния Е1: v ≠ 0 → v = 0. После чего происходит излучение энергии Еlm = h*vlm, где vlm – частота люминесценции с излучательным переходом с колебательного уровня v' = 0 на колебательный уровень v'' = 0.

излучения. Из этого следует, что частота флуоресценции vlm меньше частоты поглощенного света vabc, то есть длина волны флуоресцентного излучения λlm

больше длины волны λabc поглощенного излучения. На практике это позволяет использовать вещества, флуоресцирующие в видимом спекте,

освещая их фультрафиолетом.

У флуорофоров есть спектры поглощения энергии с максимумами, при которых флуоресценция происходит наиболее интенсивно. Однако можно перевести флуорофор в возбужденное состояние и при помощи излучения с длиной волны, заметно отличающейся от его максимума поглощения. Это называют мультифотонным возбуждением. При нём флуорофор переводят в возбужденное состояние двумя или тремя длинноволновыми фотонами, что эквивалентно возбуждению одним коротковолновым фотоном.

37

https://t.me/medicina_free

Конструкционно флуоресцентный микроскоп почти идентичен обычному световому. Основным отличием является наличие системы специальных источников света (ртутная или ксеноновая лампа, либо светодиоды) и светофильтров. В конденсорной системе микроскопа присутствует светофильтр возбуждения, который выделяет диапазон электромагнитной волны, необходимый для возбуждения флуоресценции.

Эмиссионный (запирающий) светофильтр выделяет из идущего от препарата потока света лучи с длиной волны эмиссии. Существуют широкополосные и узкополосные светофильтры. Первые пропускают свет с длиной волны большей некоторого значения, а вторые имеют узкий диапазон длин волн пропускания света. Широкополосные фильтры пропускают больше света от объекта, а узкополосные фильтры незаменимы, когда используются несколько красителей с перекрывающимися спектрами эмиссии, или если в образце имеется автофлуоресценция в области эмиссии используемого красителя.

Обычно во флуоресцентных микроскопах эмиссионный и возбуждающий фильтры вместе со светоделителем объединены в один блок,

заранее настроенный на работу с определенной группой флуорофоров,

сходных по спектрам возбуждения и эмиссии.

Основными условиями получения достоверных результатов являются:

1)Подбор набора светофильтров для используемых флуорофоров. При этом основная цель - поиск компромиссного уровня соотношения сигнала к шуму. В связи с тем, что спектры эмиссии флуорофоров часто перекрываются, возникает необходимость в использовании запирающих фильтров. В результате либо теряется часть сигнала от интересующего нас флуорофора, либо увеличивается уровень шума.

2)Подбор флуорофоров для мультифлуоресцентного эксперимента.

Необходимо подобрать метки, спектры эмиссии которых должны как можно

меньше перекрываться.

38

https://t.me/medicina_free

2.3. Конфокальная микроскопия

Сигнал от образца можно зарегистрировать с помощью следующих

приборов:

1)Микрофотометр – измеряет величину пропускания (оптическую плотность, почернение). Конструкция данного прибора подразумевает приход всего светового пучка, выделенного конфокальной диафрагмой осветителя, на фотоприемник.

2)Микрофлуориметр – измеряет интенсивность люминесценции. В

этом приборе светофильтр (монохроматор) устанавливается перед фотоприемником. Им пропускается исключительно участок спектра люминесценции образца.

3)Микронефелометр – измеряет интенсивность рассеянного света.

Его конструкция не допускает попадания прямых лучей освещающего пучка

вотверстие конфокальной диафрагмы приемника. В микроскопах,

работающих в отраженном свете, это происходит по умолчанию, в

микроскопах проходящего света применяются специальные апертурные диафрагмы.

Во флуоресцентной микроскопии, так же как и в микроскопии в рассеянном свете, контраст заметно повышается при уменьшении диаметра полевой диафрагмы. В работе [129] это рассматривалось как возможность лучше рассмотреть структуру объекта за счёт временного уменьшения размеров освещенной области. Эта идея и легла в основу конфокальной микроскопии. Патент [130] содержит схему первого известного сканирующего конфокального микроскопа.

39

https://t.me/medicina_free