2 курс / Гистология / КОЛИЧЕСТВЕННАЯ_ОЦЕНКА_ИЗМЕНЕНИЙ_В_МИКРОСТРУКТУРЕ_ПЕРИНЕЙРОНАЛЬНЫХ

более 20% массы тела. Данные по этим животным были исключены из анализа.

Подготовка ткани спинного мозга

Через 9 недель после травмы животных перед хирургическим вмешательством анестезировали углекислым газом. После того, как рефлексы исчезли, мышей перфузировали через сердце охлаждённым на льду буфером PBS (pH 7.4; 50 мл на мышь) и 4% параформальдегидом в PBS (pH 7.4, 25 мл на мышь). При подготовке животных для съёмок спинного мозга шейный отдел позвоночника был удален. Спинные части дуг позвонков были аккуратно удалены микрохирургическим пинцетом под бинокулярным микроскопом. В качестве критериев правильного рассечения использовались неповрежденная твердая мозговая оболочка и отсутствие видимых повреждений. Наконец, кусочки спинного мозга подвергали криопротекции

30% сахарозой в течение 48 ч при +4°С, а затем их замораживали на сухом льду в заливочной среде Tissue-Tek. После этого продольные горизонтальные срезы толщиной 20 мкм нарезали криотомом (Leica, Германия). Из всего набора секций были выбраны секции на уровне центрального канала.

Процедура покраски спинного мозга

Использовалась модификация ранее описанного протокола окрашивания PNN [142А]. Биотинилированный WFA (Vector Lab, США)

использовали в разведении 1:500, а связанный с Alexa Fluor 633 стрептавидин в разведении 1:100. Для окрашивания на парвальбумино (PV) были использованы мышиные моноклональные антитела (Swant). Вторичным антителом было антимышь-коза, коньюгированное с Alexa Fluor 488

(Thermo-Fisher Scientific).

Микроскопия

Съемка тканей спинного мозга проводилась на базе Центра Нейронаук Университет Хельсинки. Съёмка тканей головного мозга проводилась на базе Института Фундаментальной Медицины и Биологии Казанского Федерального Университета.

51

https://t.me/medicina_free

Изображения срезов головного мозга получали с помощью микроскопа

Zeiss Axio Imager 2.0, объектива Plan-Apochromat x20/0.8 и цифровой камеры

Zeiss AxioCam HRc (Carl Zeiss Microscopy), размер пикселя 0,51 мкм. В

каждом эксперименте параметры изображения выбирались для образцов мозга мышей P28, так что самые яркие PNN не были переэкспонированы.

Затем те же настройки были использованы для образцов P14 и P21. Срезы спинного мозга снимали объективом х10/0.6, размер пикселя 0,645 мкм. Для контроля толщины среза ткани проводили конфокальную микроскопию на микроскопе Zeiss LSM710, объектив Plan-Apochromat 40x/1.4, размер вокселя

0.3x0.3x0.3 мкм. В каждом конфокальном стаке отбирали 5 представляющих интерес областей 200x150x30 мкм для трехмерной реконструкции с помощью программного обеспечения Imaris и измерения толщины среза.

Анализ изображений

Для анализа изображений использовалось программное обеспечение

FIJI [143]. Для сравнения площади PNN и значений интенсивности на разных расстояниях от повреждения спинного мозга были количественно определены параметры (In - Imean) / Imean и (An - Amean) / Amean, где Imean

-это среднее значение интенсивности ячейки PNN для каждого среза, Amean

-это среднее значение площади PNN отдельных нейронов каждого среза, In

и An - значения интенсивности и площади PNN для отдельных нейронов.

Статистический анализ представлен как минимум для 3 независимых экспериментов с использованием одностороннего теста ANOVA (Excel, Microsoft). В экспериментах с травмой спинного мозга для парного сравнения точек данных на различных расстояниях от места повреждения использовался парный t-тест. Для оценки значимости различий в значениях площади PNN, интенсивности и значений плотности PNN-положительных клеток на разных расстояниях от травмы спинного мозга использовалась обычная реализация теста перестановки [144]. Тесты перестановки осуществлялись в MatLab. Столбики ошибок представляют стандартную ошибку среднего, символы *, ** и *** означают P < 0.05, 0.01 и 0.001,

52

https://t.me/medicina_free

соответственно. Для теста перестановки #, ## и ### обозначают R < 0.05, 0.01

и 0.001, соответственно.

Для сегментирования границ каждого отдельного PNN-несущего нейрона вручную был помечен клеточный центр с помощью инструмента

PointPicker (Рис. 11А). Затем для выбора подходящей области сегментации

(т.е. размера клетки) была разработана полуавтоматическая процедура.

Рис. 10. А – Изображение среза соматосенсорной коры головного мозга мыши до анализа.

В верхнем правом углу показана увеличенная область 1 с двумя PNN-несущими нейронами. Б – То же изображение с наложенными масками PNN, [145А]

Для каждого PNN-несущего нейрона создавалось 5 вариантов рассматриваемой области квадратной формы: 10.2; 15.3; 20.4; 25.5; 30.6 мкм

(20, 30, 40, 50, 60 пикселей, соответственно). Каждый квадрат пропускался через процедуру автоподбора порога, после чего выбирался наиболее подходящий с точки зрения оператора размер. Для обеспечения беспристрастного выбора пороговых значений интенсивности автоподбор порога был выполнен 16 различными методами, что привело к разнообразию границ PNN (Рис. 12). Всего было проанализировано 1079 PNN-несущих нейронов на срезах коры от 5 взрослых мышей.

53

https://t.me/medicina_free

Рисунок 11. А – PNN-несущий нейрон до анализа. Б – PNN-несущий нейрон с 5-тью наложенными вариантами рассматриваемой области, [145А]

Рисунок 12. Маски, созданные 16-тью методами для 5-ти вариантов областей, [145А]

У полученных масок (изображения, в которых все пиксели с яркостью ниже порога становятся черными, а выше - белыми) PNN были измерены площадь и средняя интенсивность. Затем проверялась сходимость значений средней площади на основе 5 независимых экспериментов и выбирались 4

алгоритма из 16, которые дали наиболее согласованные результаты количественного анализа - Shanbhag, Intermodes, IsoData, Mean. Гистограмма распределения интенсивности PNN нейронов была заметно вытянута справа с интенсивностью в диапазоне от 120 до 200 единиц интенсивности (рис.

13А). Среднее значение интенсивности PNN составляло 152.8 а.е. (± 37.2).

Гистограмма площади PNN нейронов демонстрировала распределение по гауссовскому типу (Рис. 13Б) со средним значением площади PNN 289.3

мкм2 (± 100.1).

54

https://t.me/medicina_free

Интенсивность флуоресценции, у.е. Площадь, мкм2

Рисунок 13. Распределение площади и интенсивности флуоресценции PNN нейронов в головном мозге мыши, [145А]

Рисунок 14. А – Изображение среза соматосенсорной коры головного мозга мыши. Б – То же изображение с наложенными масками PNN (фиолетовая область – IV слой, синяя – VI

слой), [145А]

Далее оценивались площадь PNN и обогащение хондроитинсульфатом для IV и VI слоев соматосенсорной коры (рис. 14А, Б) головного мозга мышей. У контрольных образцов интенсивность покраски на хондроитин сульфат была выше в IV слое по сравнению с нейронами, расположенными вне слоев IV и VI (рис. 15А). Никакой существенной разницы площади PNN

между изученными областями не наблюдалось (рис. 15Б.

55

https://t.me/medicina_free

Преимущества разработанного метода по сравнению с другими

методами, применявшимися ранее.

В литературе описаны два количественных подхода для анализа микроструктуры PNN низкого разрешения. В первом [146] оператор выбирает 15 случайных пикселей в области PNN вокруг тела клетки для измерения интенсивности. Очевидно, это затратный по времени метод и,

следовательно, позволяет исследовать ограниченное число клеток. Кроме того, не позволяет измерить площадь PNN. Другой метод [147, 148] основан на построении интересующей области (region of interest) вокруг нейрона с

PNN. Судя по опубликованным до настоящего времени данным, этот метод также имеет ограничения, не позволяющие измерять площадь PNN. Кроме того, оба метода основаны на данных трехмерных конфокальных стаков

(stack – формат изображения, состоящий из слоёв) и, следовательно, требуют гораздо больших затрат времени на сбор данных микроскопии по сравнению

Рисунок 15. Распределение средних площадей и интенсивности флуоресценции PNN

нейронов IV и VI слоев соматосенсорной коры головного мозга мышей (Р28), [145А]

56

https://t.me/medicina_free

3.1.1. Изменения микроструктуры PNN в постнатальном развитии

головного мозга мыши.

Мы количественно оценили динамику развития PNN в течение первого постнатального месяца у мышей в срезах соматосенсорной коры головного мозга в возрасте 14, 21 и 28 дней (Рис. 16). Всего было проанализировано

1822 нейрона у 9 мышей, в 3 независимых экспериментах.

Рисунок 16. Изображение среза соматосенсорной коры головного мозга мыши. А – 2

недели после рождения, Б – 3 недели, В – 4 недели, [145А]

Было обнаружено, что интенсивность окрашивания WFA постепенно возрастала в течение исследуемого периода развития (рис. 17А).

Гистограммы распределения интенсивности PNN вокруг отдельных клеток демонстрируют глубокие изменения распределения содержания хондроитинсульфата в популяции нейронов. В то время как интенсивность окрашивания хондроитинсульфата PNN характеризуется узким пиком в 50– 100 единиц в возрасте P14, профиль распределения заметно меняется в возрасте P21 и в конечном итоге трансформируется в асимметричное

распределение интенсивностей PNN в точке P28, характеризующееся

57

https://t.me/medicina_free

значительным расширением гистограммы в сторону большей интенсивности

(рис. 17Б). При этом никаких существенных изменений для площади отдельных PNN не наблюдалось (рис. 17В, Г). Значения средней площади отдельных PNN составляли 286.7 мкм2, 296.2 мкм2 и 282.5 мкм2 у P14, P21 и P28, соответственно.

Рисунок 17. Распределение средних площадей и интенсивности флуоресценции PNN

нейронов в головном мозге мыши в постнатальном развитии, [145А]

3.1.2. Изменения микроструктуры и плотности PNN после травмы

спинного мозга по данным эпифлуоресцентной микроскопии.

Предполагается, что ХСПГ в PNN вносят вклад в механизм нарушения регенерации после повреждения спинного мозга [149, 64]. Поэтому мы изучили посттравматические изменения площади отдельных PNN и

интенсивности окрашивания хондроитинсульфатов в спинном мозге взрослых мышей через 9 недель после латеральной гемисекции шейного

58

https://t.me/medicina_free

отдела спинного мозга (7 мышей, общее количество нейронов 3934) как предполагаемый маркер посттравматических изменений внеклеточного матрикса [61]. При отсутствии повреждений площадь и интенсивность PNN

демонстрируют равномерное распределение вдоль спинного мозга (C3 – C7,

4 контрольных животных, общее количество нейронов 1980 (Рис. 18)).

Рисунок 18. Спинной мозг мыши без травмы, [145А]

Рисунок 19. Спинной мозг мыши через 9 недель после травмы, [145А]

Через 9 недель после латеральной гемисекции (рис. 19) спинного мозга средние нормированные значения площади PNN были достоверно ниже на расстоянии 200 мкм каудально от места травмы (среднее - 0.1351, SEM 0.017, P < 0.01, R < 0.05) по сравнению с областью на расстоянии 200 мкм рострально (среднее 0.008, SEM 0.017) от места травмы (рис. 20А). Для количественного сравнения нескольких областей в поврежденном спинном мозге на основании расстояния от места повреждения мы воспользовались тестом перестановок [145]. У травмированных животных средние нормированные значения интенсивности были достоверно выше на расстояниях 1.4 мм (среднее 0.03, SEM 0.023, P < 0.05, R< 0.05), 1.6 мм

59

https://t.me/medicina_free

(среднее 0.079, SEM 0.034, P < 0.05, R< 0.01) и 1.8 мм (среднее 0.141, SEM 0.03, P < 0.01, R < 0.05) рострально от места травмы по сравнению с другими участками (например, для сравнения, cо средней нормированной интенсивностью на расстоянии 0.2 мм) шейного отдела спинного мозга (Рис.

20Б).

А

Б

Рисунок 20. Распределение средних площадей и интенсивностей флуоресценции PNN в

спинном мозге мыши после травмы (каудально – в направлении хвоста, рострально – к

голове), [145А]

Затем мы количественно оценили плотность PNN-несущих нейронов рядом с местом повреждения. Мы наблюдали устойчивое увеличение плотности PNN-несущих нейронов в каудальном направлении (рис. 21).

Такое распределение не наблюдалось у контрольных неповрежденных животных.

60

https://t.me/medicina_free