6 курс / Гастроэнтерология / Российский_журнал_гастроэнтерологии,_гепатологии,_колопроктологии (55)

4, 2009

Оригинальные исследования

Вести

Цель исследования. Сравнить уровень апо-

Aim of investigation. To compare a level of apop-

птоза периферических лейкоцитов при хронических

tosis of peripheral blood leukocytes at chronic hepatites

гепатитах (ХГ) В, С и синдроме аутоиммунного пере-

(CH) B, C and autoimmune overlap syndrome (AOS) of

креста (САП) аутоиммунного гепатита и первичного

autoimmune hepatitis and primary biliary cirrhosis.

билиарного цирроза.

Material and methods. To study level of apoptosis

Материал и методы. Для изучения -уровня апо­

and pattern of DNA of peripheral blood leukocytes 54

птоза и структуры ДНК лейкоцитов перифериче-

patients with CH have been investigated. In 12 person

ской крови были обследованы 54Мбольных ХГ. У 12

CHB was diagnosed, in 22 – CHC, in 20 – AOS. The

человек диагностирован ХГВ, у 22 – ХГС, у 20 –

control group consisted of 20 healthy volunteers without

САП. Контрольная группа состояла из 20 здоровых

symptoms of liver disease and with negative markers

добровольцев без признаков патологии печени и с

of HBV-and HCV-infections. In patients with CH and

отрицательными результатами анализов крови на

healthy persons quantity of lymphocytes and granulo-

маркеры HBV- и HCV-инфекции. У пациентов с ХГ и

cytes of peripheral blood in apoptosis state immediately

у здоровых лиц определялось количество лимфоци-

after extraction and after 24-hour incubation in culture

тов и гранулоцитов периферической крови в состоя-

medium by cytoflowmetry method, in patients with

нии апоптоза непосредственно после выделения и

AOS – only spontaneous apoptosis of total leukocytic

после 24-часовой инкубации в культуральной среде

fraction was determined.

методом проточной цитофлуориметрии, у больных с

Results. At CH patients apoptosis of both lympho-

САП – только спонтанный апоптоз общей лейкоци-

cytes and granulocytes was significantly higher in com-

тарной фракции.

parison to control immediately after extraction, as well

Результаты. У больных ХГ апоптоз как лимфо-

as after 24-hour incubation. The number of leukocytes

цитов, так и гранулоцитов был достоверно выше

of peripheral blood in a state of spontaneous apoptosis

по сравнению с контролем как непосредственно

in patients with AOS was also significantly higher in com-

после выделения, так и после суточной инкубации.

parison to scores of control group (9,9±0,8 and 4,2±0,1,

Число лейкоцитов периферической крови в состоя-

p<0,05). Comparison of average levels of spontane-

нии спонтанного апоптоза у больных с САП также

ous apoptosis of total fraction of leukocytes showed

было достоверно выше в сравнении с показателя-

absence of significant differences between CHB and

ми контрольной группы (9,9±0,8 и 4,2±0,1, p<0,05).

AOS and CHC and AOS groups (p>0,05).

Сравнение средних уровней спонтанного апоптоза

Conclusions. The level of apoptosis of peripheral

общей фракции лейкоцитов продемонстрировало

blood leukocytes at investigated patients significantly

отсутствие достоверных различий между группами

exceeds the level of apoptosis of these cells at healthy

ХГВ и САП и ХГС и САП (p>0,05).

persons. In peripheral blood of patients with CH there

Выводы. Уровень апоптоза лейкоцитов пери-

are not only leukocytes at a state of apoptosis, but also

ферической крови у обследованных больных дос-

apoptosis-committed cells, that is manifested by mono-

Оригинальные исследования

4, 2009

начение описанного в 1972 г. J.F. Kerr с

механизм, поскольку в мертвой клетке реплика-

соавт. феномена апоптоза длительное время

ция вируса становится невозможной. Поэтому «в

Знедооценивалось, но в 90-е годы минувшего

интересах» вируса – подавить апоптоз и сохра-

века интерес к механизмам его реализации значи-

нить клетки жизнеспособными. И действительно,

тельно повысился, и эта проблема стала одной из

некоторые кодируемые вирусами белки обладают

наиболее интенсивно изучаемых областей биоло-

антиапоптозной активностью, которая осуществ-

гии.

ляется подавлением функции

проапоптогенного

Апоптоз (греческое слово, соответствующее

(и противоопухолевого!) белка р53, инактивацией

листопаду: apo – отделение, ptosis – падение)

каспаз, а также усиленной экспрессией мощного

определяется как регулируемая форма програм-

ингибитора апоптоза bcl-2 [8, 10, 15]. Интересно,

мированной смерти клетки с характерными мор-

что в норме bcl-2 обнаружен в печени только в

Вести

фологическими и биохимическими признаками.

эпителии желчных протоков, постоянно контак-

Апоптозу принадлежит важнейшая роль как в

тирующих

желчью, но не в

гепатоцитах [2].

физиологических, так и в патологических услови-

О связи

экспрессии белка

Fas

и последующего

-

апоптоза

действием вируса гепатита С (HCV)

ях ввиду того, что и его подавление, и неадекват-

ное усиление ведет к патологическим изменениям

свидетельствует и то, что после успешного лече-

органов и тканей. В то время как избыточная акти-

ния интерфероном α количество Fas-положитель-

вация апоптоза, наблюдаемая, в частности, при

ных клеток резко уменьшается и коррелирует как

инфицировании клеток печениМгепатотропными

со снижением активности трансаминаз, так и с

вирусами, обусловливает разрушение печеночной

уменьшением выраженности портальной и лобу-

ткани, ослабление апоптотической гибели клеток

лярной лимфоидной инфильтрации ткани печени

(вызванное, к примеру, мутацией гена, кодирую-

[6].

щего проапоптогенный белок р53) служит одним

Иммуногистохимические

исследования пока-

из важнейших факторов канцерогенеза [2, 8].

зали, что на поверхности Т-лимфоцитов, форми-

Апоптоз выступает результатом энергозависи-

рующих воспалительный инфильтрат в печени

мого каскада молекулярных событий, включаю-

при хроническом гепатите С (ХГС), увеличена

щих четыре основных этапа [7]:

экспрессия Fas-лиганда (FasL). Секретируемый

1) инициация апоптоза при активации сигнало-

FasL, в свою очередь высвобождаемый из активи-

передающих путей;

рованных Т-лимфоцитов, может служить апопто-

2) контрольная стадия, или стадия инте-

тическим сигналом для гепатоцитов, несущих на

грации, в процессе которой соотношение внутри-

своей поверхности Fas-рецептор. У больных ХГС

клеточных индукторов и ингибиторов апоптоза

выявлено усиление Fas-опосредованного апоптоза

определяет исход событий;

гепатоцитов, при этом экспрессия FasL нарастала

3) стадия реализации программы клеточной

параллельно прогрессированию заболевания [10].

гибели, связанная с активацией каскада протеаз,

Лимфоциты, инфильтрирующие печень, рас-

после чего процесс становится необратимым;

познают присутствие вирусных антигенов на

4) элиминация погибшей клетки путем фаго-

гепатоцитах, активируются и экспрессируют FasL

цитоза.

на своей поверхности. С другой стороны, инфи-

Биохимические и морфологические признаки

цированные

гепатоциты усиливают экспрессию

апоптоза при хронических вирусных гепатитах

рецепторов Fas и повышают чувствительность к

достаточно хорошо изучены. Запуск процессов

Fas-опосредованному апоптозу [15]. Результаты

апоптоза при проникновении в гепатоцит вируса

собственных исследований указывают на значи-

следует рассматривать как своего рода защитный

тельные различия в реализации механизмов унич-

4, 2009

Оригинальные исследования

тожения инфицированных вирусом гепатоцитов:

Материал и методы исследования

при ХГС степень экспрессии Fas и FasL лимфо-

цитами воспалительного инфильтрата достоверно

Для изучения уровня апоптоза и структуры

превышала таковую при ХГВ [5]. Полученные

ДНК лейкоцитов периферической крови были

данные подтверждают ведущую роль клеточного

обследованы 54 больных ХГ. У 12 человек выяв-

Fas-опосредованного иммунного ответа организма

лен ХГВ, у 22 – ХГС, у 20 – САП. ХГ вирусной

на антигены вирусов гепатитов В и С в поврежде-

этиологии диагностировался на основании стан-

нии гепатоцитов.

дартного комплекса вирусологических, биохими-

Важно подчеркнуть, что при хронических

ческих и гистологических исследований. Диагноз

вирусных гепатитах сами лимфоциты становятся

САП основывался на подтвержденном диагнозе

объектом цитотоксического действия собственного

первичного билиарного цирроза в сочетании с

FasL или FasL гепатоцитов. Это подтверждается

любыми двумя признаками из четырех: 1) повы-

как экспрессией FasL на гепатоцитах, так и экс-

шение активности АсАТ более чем в 5 раз от верх-

прессией Fas на цитотоксических лимфоцитах,

ней границы нормы, 2) повышение уровня IgG

достоверно более высокой при ХГС по сравнению

более чем в 2 раза от верхней границы нормы,

с ХГВ [5].

3) антитела

к ядрам

или гладкой мускулатуре

Являясь универсальным биологическим меха-

в диагностическом титре (более 1:40); 4) гисто-

низмом, апоптоз при вирусных гепатитах может

логические

признаки

аутоиммунного гепатита.

приводить к избыточной гибели не только гепато-

В исследование не включались пациенты с деком-

цитов, но и других клеточных популяций, в пер-

пенсированным циррозом и сочетанной патоло-

вую очередь лейкоцитов, отражая либо системный

гией печени, тяжелыми заболеваниями других

иммуновоспалительный ответ на инфекцию, либо

органов и систем, ВИЧ-инфекцией, а также лица,

внепеченочную персистенцию вируса [4, 12].

ранее получавшие противовирусную или имму-

При аутоиммунной патологии печени иссле-

носупрессивную терапию. Контрольная группа

дований, посвященных апоптозу гепатоцитов и

состояла из 20 здоровых добровольцев без при-

других клеточных популяций, существенно мень-

знаков патологии печени и с отрицательными

ше. Усиление программированной гибели клеток

результатами анализов крови на маркеры HBV-

Вести

описано для всех аутоиммунных заболеваний

HCV-инфекции.

печени, но точные механизмы данного процесса

У пациентов с ХГВ, ХГС и у здоровых

детально не изучены. В большинстве случаев, как

доноров определялось количество лимфоцитов и

-

гранулоцитов периферической крови в состоя-

и при вирусных гепатитах, доминирует «внеш-

ний» путь апоптоза, инициируемый активацией

нии апоптоза непосредственно после выделения

«рецепторов смерти» на поверхности гепатоцитов

после 24-часовой инкубации в культуральной

и холангиоцитов [11]. Ведущая роль принадлежит

среде методом проточной цитофлуориметрии, у

взаимодействию Fas–FasL. ПриМэтом изменения в

больных с САП – только спонтанный апоптоз

интенсивности апоптоза наблюдаются не только

общей лейкоцитарной фракции.

непосредственно в ткани печени, но и в моно-

Выделение мононуклеарных и полиморфно-

нуклеарах периферической крови [16]. Вместе с

ядерных лейкоцитов из периферической крови

тем наряду с внешним иногда реализуется «внут-

проводили одноэтапным методом с использова-

ренний» путь – через повреждение митохондрий

нием двухслойного градиента Ficoll–Paque в

с участием рецепторов семейства bcl-2. В обоих

стерильных условиях. Для этого гепаринизиро-

случаях эффекторные каспазы расщепляют кле-

ванную (25 ед. гепарина/1 мл крови) цельную

точные структуры, что ведет к выходу продуктов

венозную кровь наслаивали на равный объем гра-

апоптоза в циркуляцию.

диента фиколла с плотностями 1,095 и 1,077 г/мл

С точки зрения патогенеза аутоиммунных

и центрифугировали при 400 g в течение 30 мин

процессов представляет интерес факт того, что,

при комнатной температуре. Из крови получа-

несмотря на выделение апоптоза как обособлен-

ли две фракции лейкоцитов: мононуклеарные и

ной формы клеточной гибели, он может сочетать-

полиморфно-ядерные в виде двух слоев клеток.

ся с другими ее формами (некроз, аутофагия).

Клетки осторожно собирали и отмывали два-

Если апоптотические клетки своевременно не

жды в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) (рН

элиминируются макрофагами, они остаются в

7,4). Фракция мононуклеарных лейкоцитов была

качестве потенциальных источников антигенов.

представлена лимфоцитами (80–90%), моноци-

Аномальная презентация последних запускает

тами (15–20%) и примесью гранулоцитов (менее

цепь аутоиммунных реакций [3, 13].

3%), фракция полиморфно-ядерных лейкоци-

Цель исследования состояла в сравнении

тов – в основном гранулоцитами.

уровня апоптоза периферических лейкоцитов при

Выделенные клетки периферической крови в

ХГВ, ХГС и синдроме аутоиммунного перекре-

концентрации 1 млн/мл культивировали в 24-

ста (САП) аутоиммунного гепатита и первичного

луночных пластиковых культуральных планшетах

билиарного цирроза.

(Costar) в среде RPMI 1640 (Sigma), содержащей

Оригинальные исследования

4, 2009

10% инактивированной эмбриональной сыворотки

наз была умеренно повышенной у 4 (20%) из них

крупного рогатого скота (Gibco) и 50 мкг/мл

и значительно повышенной (более 5 норм) – у

гентамицина – при 37 °С в увлажненной атмо-

16 (80%). Во всех случаях наблюдался биохи-

сфере, содержащей 5% CO2. Регистрация апо-

мический синдром холестаза. Уровень щелочной

птоза клеток осуществлялась с помощью проточ-

фосфатазы был умеренно

повышен у 7 (35%)

ной цитофлуориметрии после окрашивания ДНК

и значительно повышен у 13 (65%) пациентов.

йодистым пропидием в качестве флуорохрома и

Незначительное повышение активности γ-глута-

путем измерения процента гиподиплоидных кле-

милтранспептидазы отмечено у 6 (30%), умерен-

ток на проточном цитофлуориметре-сортировщике

ное – у 10 (50%) и значительное – у 4 (20%)

клеток EPICS. Клетки в концентрации 1 млн/мл

больных. Уровень сывороточного билирубина

фиксировали в 70% ледяном этаноле в течение

был незначительно повышен (не более чем в 1,5

30–60 мин при 4 °С и хранили до исследования

раза от верхней границы нормы) у 12 (60%) и

при –20 °С в течение 2–3 нед.

умеренно повышен (3–5 норм) – у 5 (25%) боль-

Фиксированные клетки дважды отмывали от

ных, значительная гипербилирубинемия (более 5

этанола ФCБ (с рН 7,4, содержанием 0,1%

норм) зарегистрирована у 3 (15%) пациентов.

Тритона Х-100, 0,1 мМ ЭДТА, 0,05 мг/мл рибо-

Установлено, что у больных ХГ апоптоз как

нуклеазы А и 50 мкг/мл йодистого пропидия) и

лимфоцитов, так и гранулоцитов был достоверно

ресуспендировали в 1 мл ДНК-окрашивающего

выше по сравнению с контролем как непосред-

реагента в течение часа при комнатной темпера-

ственно после выделения, так и после суточной

туре. Окрашенные клетки немедленно анализиро-

инкубации (см. таблицу и рисунок). Более интен-

вали на проточном цитофлуориметре при длине

сивный переход клеток в апоптоз наблюдался в

волны возбуждения 488 нм и длине волны эмис-

подгруппе больных гепатитом С, хотя здесь следу-

сии 680 нм. Процент клеток в состоянии апоптоза

ет учитывать роль разного количества пациентов

(процент гиподиплоидных клеток со сниженной

в подгруппах (12 с ХГВ и 22 с ХГС). Выявлена

по сравнению с диплоидными флуоресценцией

также корреляция между степенью повреждения

ДНК) подсчитывали по программе STAT PACK,

ДНК лимфоцитов и гранулоцитов и накоплением

анализируя флуоресценцию не менее 10 000 кле-

клеток в состоянии апоптоза после инкубации.

ток в каждом образце [4].

Вести

Помимо этого, после суточной инкубации коли-

чество лейкоцитов обеих популяций в апоптозе

Результаты исследования

-

достоверно коррелировало с сывороточной концен-

и их обсуждение

трацией фактора некроза опухоли α (TNF-α), что

соответствует данным литературы [4, 9, 14].

Результаты биохимического

анализа крови

Уровень

спонтанного

апоптоза

лейкоцитов

больных ХГ показали, что активность сывороточ-

периферической крови у больных с САП также

ных трансаминаз в этой группеМбыла нормаль-

был достоверно выше в сравнении с показателями

ной или почти нормальной (менее 1,5 нормы) у

контрольной группы – соответственно 9,9±0,8 и

10 (30%) пациентов, незначительно повышенной

4,2±0,1% (отличия достоверны, р<0,05).

(1,5–3 нормы) – у 17 (50%) и умеренно повы-

Сравнение у обследуемых средних уровней

шенной (3–5 норм) – у 7 (20%). Достоверных

спонтанного апоптоза общей фракции лейкоци-

различий по биохимической активности между

тов продемонстрировало отсутствие достоверных

ХГВ и ХГС не отмечено. Клинически значимого

различий между группами ХГВ и САП и ХГС и

(более 1,5 нормы) повышения уровня щелочной

САП (p>0,05).

фосфатазы, γ-глутамилтранспептидазы, общего и

Изучение

взаимосвязи

между

активностью

прямого билирубина, γ-глобулинов у обследован-

сывороточных трансаминаз и уровнем апоптоза

ных больных не обнаружено.

мононуклеарных и полиморфно-ядерных лейко-

При анализе биохимических показателей паци-

цитов выявило отсутствие значимой корреляции

ентов с САП выявлено, что активность трансами-

между этими параметрами во всех группах.

Уровень апоптоза лейкоцитов

периферической крови у здоровых доноров и больных ХГ вирусной этиологии, %

Время инкубации

Исследуемая группа

лимфоцитов

гранулоцитов

0 ч

24 ч

0 ч

24 ч

Здоровые доноры, n=15

1,2±0,2

3,6±0,7

9,2±1,6

22,0±3,0

ХГВ, n=12

5,9±1,7*

10,0±2,9*

14,0±4,2*

32,7±4,2*

ХГС, n=22

8,8±1,8*

18,2±3,2*

15,9±1,8*

38,0±4,4*

4, 2009

Оригинальные исследования

заражение. Вирусы гепатита оказывают прямое

Линейная шкала

Логарифмическая шкала

A

A

1

проапоптотическое влияние на инфицированные

клетки в процессе вирусной репликации вслед-

1

ствие воздействия вирусных белков рХ виру-

са гепатита В и core-белка вируса гепатита С.

Трансактиваторные свойства указанных белков

продемонстрированы при изучении их влияния

2

на клетки in vitro. Кроме того, важную роль в

развитии апоптоза может играть опосредованное

действие вирусных белков, секретируемых в

Б 2

Б

2

1

процессе репликации вирусов в клетке [10]. Оно

приводит к увеличению чувствительности клетки

, %

к апоптозиндуцирующим

факторам (так назы-

ваемая проапоптогенная готовность). Результаты

клеток

наших исследований также подтверждают такую

возможность.

Количество

1

Высокий уровень

проапоптотических

цитокинов в сыворотке крови больных.

Цитотоксические лимфоциты при ХГ вирусного

Количество ДНК

и аутоиммунного генеза

продуцируют ряд про-

воспалительных цитокинов и ростовых факторов:

Анализ апоптоза методом проточной цитофлуоримет-

TNF-α, интерферон γ, трансформирующий фак-

рии в лимфоцитах периферической крови здорового

тор роста-β и др. Накоплены данные о повышен-

добровольца (А) и больного ХГС (Б) через 24 ч инку-

ном содержании указанных цитокинов в крови

бации клеток в культуральной среде.

больных. Важно отметить, что TNF-α самостоя-

Гистограмма, отражающая клеточный цикл лимфо-

тельно может выполнять роль индуктора апоптоза

цитов. По оси абсцисс – интенсивность флуоресцен-

ции, по оси ординат – количество клеток. 1 – пик

некоторых типов клеток. Кроме того, имеются

диплоидной ДНК (соответствует фазе G0/G1 клеточ-

сведения о том, что рХ-белок, экспрессируемый

ного цикла), 2 – пик гиподиплоидной ДНК (соответ-

клеточными линиями в экспериментах in vitro,

ствует клеткам в состоянии апоптоза)

повышает чувствительность клеток к TNF-α, в

норме резистентных к его эффектам, и вызыва-

В результате проведенного исследования обна-

ет их гибель путем апоптоза. Core-белок вируса

ружено, что и у больных хроническими

вирус-

гепатита С также взаимодействует с рецептором к

-

ными гепатитами, и у больных с САП наблюдаВести- TNF-α способствует in vitro развитию апоптоза

ется достоверно более высокийМпо сравнению со

при действии TNF-α. Таким образом, провоспа-

здоровыми добровольцами уровень апоптоза как

лительные цитокины прямо или косвенно участ-

лимфоцитов, так и гранулоцитов периферической

вуют в индукции апоптоза клеток при вирусной

крови. Анализируя полученные данные, следует

инфекции или аутоиммунном процессе [6, 9, 12].

отметить, что высокий уровень апоптоза лейкоци-

Ранее мы обнаружили увеличение доли лимфоци-

тов у больных по сравнению со здоровыми может

тов и гранулоцитов в состоянии апоптоза после

свидетельствовать о наличии общих механизмов

суточной инкубации клеток in vitro в питательной

апоптоза в этих клетках. Наиболее вероятными,

среде у больных ХГВ и ХГС с более высоким

на наш взгляд, механизмами индукции апопто-

уровнем сывороточного TNF-α [4]. Полученные

тической гибели клеток крови при исследуемых

результаты свидетельствуют о том, что повышен-

хронических заболеваниях печени могут быть

ный уровень провоспалительных/проапоптотиче-

следующие.

ских цитокинов в сыворотке крови больных ХГ

Цитопатическая

активность

вирусов

может быть одним из факторов, коммитирую-

гепатитов В и С. Обнаружение факта репли-

щих лейкоциты, находящиеся в периферическом

кации вирусов гепатита в лейкоцитах перифери-

русле, к апоптозу.

ческой крови позволяет рассматривать послед-

Накопление нерепарированных поврежде-

ние как независимую от печени мишень дейст-

ний ДНК клеток под действием активных

вия вирусов. Действительно, в настоящее время

форм кислорода. Активные метаболиты кисло-

можно говорить лишь о преимущественном гепа-

рода, продуцируемые гранулоцитами и моноци-

тотропизме HBV и HCV. Открытие связывания

тами при взаимодействии с антигенами, играют

поверхностного белка HCV E2 с белком CD81,

важную роль в защите организма от инфекции,

экспрессируемым большим количеством клеток,

но могут вызывать также повреждение ДНК

включая гепатоциты, В- и Т-лимфоциты, а также

окружающих клеток и повреждение тканей при

гранулоциты, подтверждает рецепторопосредо-

воспалении, в том числе иммунном. Накопление

ванное проникновение вируса в эти клетки и их

нерепарированных повреждений ДНК, возни-

Оригинальные исследования

4, 2009

кающих в результате окислительного стресса,

для сравнения группу пациентов с САП, объе-

является одним из триггеров апоптоза. Фагоциты

диняющим разнородные нозологические формы

сами испытывают повреждающее действие окис-

(аутоиммунный гепатит и первичный билиар-

лительного взрыва и могут индуцировать апоптоз

ный цирроз) с общим аутоиммунным патогене-

лимфоцитов. Роль активных форм кислорода в

зом. Полученные результаты свидетельствуют об

индукции повреждения клеток при вирусных гепа-

отсутствии значимых различий между уровнем

титах подтверждается в ряде сообщений об изме-

апоптоза лейкоцитов периферической крови у

нении функционально-метаболического состояния

больных ХГВ, ХГС и САП. В то же время можно

лейкоцитов крови у больных ХГВ и ХГС, в част-

указать на тенденцию активации апоптоза лейко-

ности усилении процессов свободнорадикального

цитов по мере усиления иммунной составляющей

окисления в мембранах клеток и нарушении их

патогенеза: САП > ХГС > ХГВ. Это может быть

внутриклеточного метаболизма [1].

объяснено с позиции доминирования иммуно- и

Гибель клеток, обусловленная взаимо-

цитокинопосредованного («внешнего») механизма

действием на их поверхности Fas и FasL.

апоптоза при данных нозологических формах.

Эта форма гибели может иметь место для акти-

Таким образом, результаты проведенного

вированных лимфоцитов. После активации в

исследования подтверждают роль апоптоза как

результате взаимодействия с антигенами Т-лим-

унифицированного механизма повреждения кле-

фоциты экспрессируют

повышенное количество

ток печеночного и костномозгового происхож-

FasL на своей поверхности. Персистенция попу-

дения независимо от этиологического фактора.

ляции активированных Т-клеток после элимина-

Отсутствие значимой корреляции между актив-

ции антигена могла бы привести к ряду неже-

ностью сывороточных трансаминаз и уровнем

лательных последствий, в том числе к развитию

апоптоза лейкоцитов периферической крови, по

аутоиммунных и лимфопролиферативных нару-

нашему мнению, вполне закономерно. Активность

шений. Удаление активированных лимфоцитов

АлАТ и АсАТ отражает цитолитические процессы

из циркуляторного русла осуществляется путем

в печени, которые не имеют непосредственного

их апоптоза с помощью системы Fas/FasL, когда

отношения к клеткам периферической крови и не

лимфоциты выступают в роли и эффекторов,

влияют на их жизнеспособность.

клеток-мишеней – так называемая AICD (activa-

tion-induced cell death)

– гибель

клеток путем

Выводы

апоптоза в результате активации.

Нейтрофилы

-

1. Уровень апоптоза лейкоцитов перифериче-

и моноциты конститутивно экспрессируют Fas,

а нейтрофилы еще и FasL. Коэкспрессия Fas

ской крови у пациентов с ХГВ, ХГС и САП дос-

FasL может являться возможным механизмом,

товерно превышает таковой у здоровых лиц.

помощью которого зрелые нейтрофилы человекаВести2. периферической крови больных ХГ при-

подвергаются

быстрому

спонтанномуМапоптозу

сутствуют не только лейкоциты в состоянии апо­

(в течение 48 ч более 50% популяции). Кроме

птоза, но и коммитированные к нему клетки, что

того, возможна гибель нейтрофилов, когда мем-

проявляется усилением апоптоза мононуклеарных

браносвязанный Fas взаимодействует с FasL,

и полиморфно-ядерных лейкоцитов после 24-часо-

экспрессируемым соседними нейтрофилами [10,

вой инкубации в культуральной среде.

12, 16].

3. Значимые различия между уровнем апопто-

Таковы наиболее вероятные, на наш взгляд,

за лейкоцитов периферической крови у пациентов

механизмы индукции апоптоза лейкоцитов у боль-

с ХГВ, ХГС и САП отсутствуют, что указывает

ных хроническими вирусными и аутоиммунными

на роль апоптоза в качестве унифицированного

заболеваниями

печени.

Мы намеренно выбрали

механизма повреждения клеток.

4, 2009

Оригинальные исследования

Оригинальные исследования

4, 2009

Цель исследования. Изучить возможности при-

Aim of investigation. To study potentials of non-

менения неинвазивных методов оценки фиброза

invasive methods application for assessment of liver

Вести

печени при скрининговом обследовании больных

fibrosis at screening diagnosis of patients with diffuse

диффузными заболеваниями печени.

liver diseases.

Материал и методы. Обследовано 188 HCV

Material and methods. Overall 188 HCV RNA-

RNA-позитивных больных и 61 HBV DNA позитив-

positive patients and 61 HBV DNA-positive were inves-

-

ный. Стадия заболевания у всех пациентов под-

tigated. The stage of disease in all patients was verified

тверждалась морфологическим исследованием

by morphological study with assessment of histological

определением индекса гистологической активности

activity index (HAI) and stage of fibrosis (F). These data

(ИГА) и стадии фиброза (F). Эти данные сопостав-

were compared to data of non-invasive evaluation of liver

лялись с данными неинвазивнойМоценки фибро-

fibrosis – i.e. results of biochemical tests (de Ritis coef-

за печени – результатами биохимических тестов

ficients, APRI), ultrasound investigation with Doppler

(коэффициенты де Ритиса, APRI), ультразвуковых

ultrasonography, videodensitometry, elastometry (EM)

исследований с допплерографией, видеоденсито-

by FibroScan device («EchoSens», France).

метрией, эластометрией (ЭМ) с помощью аппарата

Results. Significant differences in scores of liver tis-

FibroScan («EchoSens», Франция).

sue elasticity in relation to stage of fibrosis (F0, F1, F2,

Результаты. Выявлены достоверные различия в

F3, F4) – р<0,001 were revealed at HCV-infection and

показателях эластичности ткани печени в зависимо-

р<0,05 at HBV-infection. EM sensitivity and specificity

сти от стадии фиброза (F0, F1, F2, F3, F4) – р<0,001

ranged from 0,8 to 0,99 (area under the ROC-curve).

при HCV-инфекции и р<0,05 при HBV-инфекции.

Canonical discriminant analysis with drawing of territo-

Чувствительность и специфичность ЭМ составила

rial map, that allow to define fibrosis stage as mild, mod-

от 0,8 до 0,99 (площадь под ROC-кривой). Проведен

erate or severe, using data of ultrasound investigation,

канонический дискриминантный анализ с составле-

was carried out.

нием территориальной карты, позволяющий, исполь-

Conclusions. Application of non-invasive methods

зуя данные ультразвукового исследования, отнести

of evaluation of fibrosis is reasonable at primary inves-

стадию фиброза к легкой, умеренной и тяжелой.

tigation of HCV RNA-and HBV DNA-positive patients.

Выводы. Применение неинвазивных методов

Today high diagnostic accuracy allows to consider

оценки фиброза целесообразно при первичном

elastometry as a method of choice in diagnostics of liver

обследовании HCV RNA- и HBV DNA-позитивных

fibrosis in diffuse liver diseases.

больных. Высокая диагностическая точность позво-

Key words: chronic hepatitis, liver cirrhosis, hepato-

ляет сегодня считать эластометрию методом выбо-

cellular carcinoma, HCV-and HBV-infection, ultrasound

ра диагностики фиброза печени при ее диффузных

elastometry, liver biopsy.

поражениях.

Ключевые слова: хронический гепатит, цирроз

печени, гепатоцеллюлярная карцинома, HCV- и HBV-

инфекция, ультразвуковая эластометрия, биопсия

печени.

4, 2009

Оригинальные исследования

звестно, что хронические гепатиты (ХГ)

Она может ответить на вопрос, какие патологи-

В и С, цирроз печени (ЦП) в их исходе

ческие изменения имеются в печени и (даже учи-

Ии гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК)

тывая названные выше ограничения) более или

– звенья одного процесса. Переход одной стадии

менее точно определить активность воспалитель-

в другую – вопрос времени. Своевременная диаг-

ного процесса и стадию фиброза. Динамическое

ностика этих состояний – залог выработки опти-

наблюдение за фиброзом с помощью биопсии

мальной тактики ведения больного, профилактики

затруднено ввиду описанных ограничений и инва-

осложнений.

зивности самого метода. Существует риск разви-

«Золотым стандартом» в диагностике фиброза

тия осложнений (хотя он и невысок): около 30%

остается биопсия печени (рис. 1). Определение

пациентов жалуются на боль в месте биопсии,

стадии фиброза (F) при ХГ принято прово-

у 0,3% возникают тяжелые осложнения, леталь-

дить по шкале Metavir (рис. 2) или Ishak [2].

ность после выполнения процедуры достигает

Однако биопсия печени как метод оценки фиб-

0,1% [1, 13, 14]. Все это сделало необходимым

роза имеет серьезные ограничения, обусловлен-

поиск надежных неинвазивных методов диагно-

ные объективными и субъективными причинами.

стики фиброза как при первичном обследовании,

К объективным причинам относится нерепрезен-

скрининге больных, так и при последующем

тативность биоптата (обычно это 1/500 000 часть

мониторинге.

ткани органа), который при наличии диффузного

Для оценки содержания фиброзной ткани в

поражения может иметь разные значения стадии

печени предложены отдельные широко применяе-

фиброза и индекса гистологической активности

мые и доступные в клинической практике пока-

(ИГА). Сравнение результатов парных биопсий

затели (количество тромбоцитов) и их различные

(из правой и левой долей печени), проведенных у

соотношения (АсАТ/АлАТ – коэффициент де

пациентов, инфицированных вирусом гепатита С,

Ритиса, АсАТ/количество тромбоцитов – APRI и

показало, что расхождение на 1 балл индекса вос-

др.). Их именуют суррогатными маркерами фиб-

паления имелось в 25% случаев; у 14,5% больных

роза [12]. В настоящее время исследованы также

после биопсии из одной доли печени был постав-

возможности истинных маркеров, увеличение

лен диагноз ЦП, из другой доли – выраженный

содержания которых позволяет косвенно судить

Вести

фиброз [10]. Получение адекватного объема био-

о процессах фиброгенеза и фибринолиза. К ним

птата (длиной минимум 25 мм с захватом не менее

относится определение коллагеназ и их ингиби-

11 портальных трактов) не гарантировано при

торов,

продуктов синтеза коллагена, гликопро-

-

теидов

полисахаридов (гиалуроновая кислота).

чрескожном доступе [5]. К субъективным причи-

нам различий в стадиях фиброза в одном и том же

качестве одиночных тестов применимость этих

биоптате относят квалификацию морфолога: при

маркеров существенно ограничена, поскольку,

оценке разными специалистами они могут наблю-

отражая метаболизм экстрацеллюлярного мат-

даться в 20% случаев [3, 4].

М

рикса, они могут давать ложноположительный

Вместе с тем биопсия остается ключевым мето-

результат в диагностике фиброза при наличии

дом диагностики рассматриваемых заболеваний.

активного воспаления в ткани печени. Кроме

Оригинальные исследования

4, 2009

ее проведению (скрининг, мониторинг

на фоне лечения и без него) [6, 7, 14].

Датчик вызывает

Скорость волн оценивается

Ограничениями являются наличие асци-

эластические волны

та, избыточная жировая клетчатка, узкие

в печени

в области расположения датчика

на глубине от 2,5 до 6,5 см

межреберные промежутки у пациента. По

от поверхности кожи

данным В.А. Исакова, получены удовле-

2,5 см

Измеряемый

творительные

результаты клинического

объект

использования

следующих пороговых

значений эластичности: 5,8 кПа – для

определения границы между стадиями F0

4 см

и F1 (Metavir), 7,2 кПа – для разграни-

чения стадий F1 и F2, 9,5 кПа – стадий

Биопсия печени: 1/50 000 часть печени

F2 и F3, 12,5

кПа – для определения

границы между тяжелым фиброзом и

FibroScan: 1/500 часть печени

ЦП (F4). При этом диагностическая точ-

ность метода при использовании указан-

Рис. 3. Принцип проведения и оценки ульразвуковой

ных выше критериев составила 88,6% –

эластометрии

для установления отсутствия фиброза,

того, они неспецифичны и могут отражать процес-

79,6% – для стадии F1, 86,4% – F2, 90,9% – F3

сы, происходящие в других органах и системах.

и 95,5% – при наличии цирроза [12]. Таким обра-

Комбинированные системы оценки, основанные

зом, эластометрия позволяет неинвазивно оценить

на сочетанном применении истинных и суррогат-

стадию фиброза печени как при первичном обсле-

ных маркеров фиброза (Fibrospect 2, Hepascore,

довании, так и при мониторинге пациента на фоне

Fibrotest и др.), представляются более информа-

лечения и без него (рис. 4).

тивными

в определении выраженного фиброза

Цель исследования: оценить возможности неин-

и цирроза за счет увеличения

специфичности

вазивных методов оценки фиброза как скрининго-

[1, 11]. В ряде работ показана высокая диагно-

вой методики для определения стадии фиброза у

Вести

стическая точность этих методов, составляющая

лиц

хронической HBV- и HCV-инфекцией.

80% для диагностики выраженного фиброза

92% – для ЦП [13].

-

Материал и методы исследования

При накоплении фиброзной ткани изменяются

физические свойства печени. В связи с этим пер-

Всего обследовано 188 HCV RNA-позитивных

спективным является определение плотности (эла-

больных 61 – HBV DNA-позитивный. Среди

стичности) печеночной ткани с помощью косвен-

них было 138 мужчин и 111 женщин в возрасте

ных или прямых методов. К косвеннымМметодам

от 18 до 60 лет. Стадия заболевания, в том числе

относят определение величин скорости кровотока

наличие ГЦК, у всех подтверждалась морфоло-

в портальной системе, которые меняются в зави-

гическим исследованием. В исследуемую группу

симости от плотности печени [8, 9, 14]. К прямым

вошли 147 пациентов с ХГС (по стадиям фиб-

методам принадлежит магнитно-резонансная эла-

роза: F0 – 29, F1 – 67, F2 – 40, F3 – 11), 33

стография (ЭГ) [15], несомненным достоинством

больных ЦП в исходе ХГС – 23 без варикозно-

которой является возможность оценить плотность

расширенных вен пищевода (ВРВП), 10 с ВРВП

печени в целом как органа, недостатком – доро-

говизна и сложность выполнения.

К прямым методам оценки

стадии фибро-

за, определяемой в кПа, относят ультразвуко-

вую эластометрию (ЭМ) с помощью аппарата

FibroScan («EchoSens», Франция) – рис. 3. Этим

методом получено достаточное количество данных

в проведенных контролированных исследованиях

[14]. Метод обладает меньшей чувствительно-

стью, чем магнитно-резонансная ЭГ, определяя

эластичность печени в столбике ткани, в 500 раз

Нет необходимости голодать

превышающем объем взятого биоптата, но все

Продолжительность

же значительно меньшем, чем весь орган. К дос-

исследования 5 мин

10 успешных замеров

тоинствам ультразвуковой ЭМ следует отнести

Срединное значение = истинное значение

простоту,

неинвазивность, низкую стоимость,

Результат выражается в кПа

а также клиническую значимость (прогнозиро-

Противопоказание: асцит

вание осложнений портальной гипертензии при

Рис. 4. Преимущества ультразвуковой эластометрии

циррозе).

Это определяет широкие показания к