Российская

гастроэнтерологическая

ассоциация Российское общество по изучению печени

Учредитель:

Российская гастроэнтерологическая ассоциация.

Периодичность издания:

1 раз в 2 месяца.

Тираж 3000 экз.

Подписной индекс 73538.

Журнал зарегистрирован Комитетом РФ по печати 15.12.1994 г. (Регистрационный № 013128).

Founder: Russian Gastroenterological

Association.

Published bimonthly.

Circulation 3000 copies.

Subscription No 73538.

The journal is registered by the Press Committee of Russian Federation on December 15, 1994. (Reg. No. 013128).

119881, ГСП-3, Москва, ул. Погодинская, 5, кафедра

пропедевтики внутренних болезней Московской медицинской академии,

“Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии”.

“Russian Journal of Gastroenterology, Hepatology, Coloproctology”,

The Propaedeutics Chair of Internal Medicine, The Moscow Medical Academy, Pogodinskaya ul., 5, Moscow, 119881, GSP-3, Russia.

Российский журнал Гастроэнтерологии, Гепатологии, Колопроктологии

Научно практический журнал

Издательский дом «РМ-Вести»

Главный редактор:

В.Т.Ивашкин

Редакционная коллегия:

Е.К.Баранская

С.А.Булгаков

Г.И.Воробьев

П.Я.Григорьев А.В.Калинин (зам. главного редактора) З.А.Лемешко А.С.Логинов А.Ф.Логинов И.В.Маев М.В.Маевская А.М.Ногаллер Ю.М.Панцырев А.И.Парфенов

Г.Г.Пискунов (ответственный секретарь) Л.М.Портной С.И.Рапопорт В.В.Серов Ю.В.Тельных А.С.Трухманов А.И.Хазанов С.А.Чернякевич

А.А.Шептулин (зам. главного редактора)

Редакционный совет:

Editor-in-chief:

V.T. Ivashkin

Editorial board:

Ye.K.Baranskaya

S.A.Bulgakov

G.I.Vorobiev

P.Ya.Grigoriev

A.V.Kalinin (deputy editor-in-chief) Z.A.Lemeshko

A.S.Loginov

A.F.Loginov

I.V.Mayev

M.V.Mayevskaya

A.M.Nogaller

Yu.M.Pantsyrev

A.I.Parfyenov

G.G.Piskunov (senior contributing editor) L.M.Portnoy

S.I.Rapoport

V.V.Serov

Yu.V.Tel’nykh

A.S.Troukhmanov

A.I.Khazanov

S.A.Chernyakevich

A.A.Sheptulin (deputy editor-in-chief)

Editorial council:

После открытия Marschall и Wаrren в 1983 г. патогенетической зависимости развития острого и хронического гастрита от инфекции Helicobacter pylori

(НР) и последующих активных исследований, проведенных многочисленными учеными, возникло понятие о НР-ассоциированных заболеваниях. К ним относят хронический гастрит (типа В – бактериальный по старой классификации), язвы желудка и двенадцатиперстной кишки, рак желудка и MALT-лимфому низкой степени злокачественности.

В связи с этим дальнейшие усилия исследователей были направлены не только на поиск адекватных режимов эрадикации (уничтожения) инфекции НР, но и на разработку оптимальных способов диагностики этой инфекции. Были адаптированы или созданы заново многочисленные прямые и непрямые методы верификации бактерий в желудке, основанные на непосредственном их обнаружении в биопсийном материале или на выявлении продуктов метаболизма НР в организме человека. Почти все они сопоставимы по надежности и специфичности и достаточно хорошо работают при первичной диагностике и высокой степени обсемененности слизистой оболочки.

Однако после лечения, когда под влиянием неадекватной эрадикационной терапии популяция бактерий не уничтожается, а существенно уменьшается или переходит в кокковую форму, большинство диагностических методов становятся малонадежными. Появляются многочисленные сомнительные и ложноотрицательные результаты, существенно влияющие на прогноз заболевания и тактику дальнейшего ведения больных.

Вначале 90-х годов появились публикации [1–6, 8], в которых предложено использовать цитологический метод в качестве простого, быстрого

ичувствительного способа диагностики инфекции НР. В зависимости от способа получения материала из желудка для дальнейшего цитологического изучения различают несколько вариантов метода:

– crush cytology – раздавливание биоптата;

– imprint, или touch cytology – прикосновение

иотпечаток люминальной поверхности биоптата к предметному стеклу;

– brush cytology – получение пристеночной слизи с помощью специальной щеточки, входящей в комплект современных эндоскопов.

Однако цитологический метод не нашел широкого распространения, поскольку в то время “золотым” диагностическим стандартом являлось гистологическое изучение биоптатов, показывающее не только наличие инфекта, но и взаимоотношение бактерий с тканевыми структурами и патологические сдвиги в самой слизистой оболочке желудка.

Тормозом к внедрению цитологической диагностики в последнее время послужила общая тенденция перехода на неинвазивные методы. Были

разработаны дыхательные тесты с использованием стабильных изотопов углерода 13С – надежный и неинвазивный (хотя и дорогостоящий) способ верификации НР-инфекции.

В1998 г. появился еще один вариант неинвазивной диагностики с помощью иммуноферментной детекции антигенов НР в кале. Однако до широкого внедрения этих перспективных методов в клиническую практику в нашей стране пройдет еще очень длительный период. Поэтому вопрос о простом, надежном и быстром методе

обнаружения НР в желудке по-прежнему остается актуальным.

Поскольку детали различных вариантов получения диагностического материала из желудка для цитологического изучения ни в одной из перечисленных публикаций не описаны, мы в своем исследовании поставили цель: выявить оптимальный способ (с точки зрения выявления НР) взятия материала из желудка и отработать методику и режимы наилучшей окраски цитологического препарата для надежной верификации НР-инфекции.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

На базе ГКБ № 15 г. Москвы проводили комплексное исследование динамики репарации язв желудка и двенадцатиперстной кишки, осложненных кровотечением. В клинике 108 пациентам осуществили эндоскопическое обследование с одновременным гемостазом и взятием биопсийного материала. В последующем полноценность остановки кровотечения контролировали эндоскопически на 1, 2, 3, 8, 14, 21, 35 и 45-е сутки.

В начале исследования у 15 пациентов одновременно получали биопсийный материал и пристеночную слизь желудка для приготовления трех видов цитологических препаратов: путем раздавливания биоптата (crush), отпечатка с люминальной поверхности биоптата (touch, или imprint) и распределения на предметном стекле слизи желудка, собранной brush-способом из 5–6 мест каждого отдела (тело и антрум).

Цитологический препарат подсушивали на воздухе и до исследования хранили в холодильнике. Перед исследованием препараты фиксировали над пламенем горелки, окрашивали по одному из используемых в цитологии методов (толуидиновым синим, по Гимзе, акридиновым оранжевым по Граму, серебрением по Вартину–Старри) и изучали под иммерсией в световом микроскопе при увеличении в 1000 раз. Результаты цитологического исследования сопоставляли между собой, с данными гистологического изучения биопсийного материала и уреазного De-Nol-теста.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Проведенное исследование показало, что наименьшей надежностью в диагностике (при использовании обычных методов фиксации) НР-ин- фекции обладает гистологический метод. При его использовании даже для первичной диагностики в 4 (26,7±11,8%) случаях были получены ложноотрицательные результаты. После эрадикационной терапии количество ложноотрицательных результатов, полученных при гистологическом изучении, существенно возрастало (8 случаев – 53,3±5,2%).

Кроме того, степень обсемененности НР слизистой оболочки желудка в гистологических препаратах всегда была значительно занижена относительно цитологических. Конечно, такого количества случаев недостаточно для обоснованной статистики, и мы не акцентируем на этом внимания. Однако, вне сомнений, количество ложноотрицательных результатов при гистологической диагностике существенно выше вследствие отмывания поверхностной слизи (зоны обитания основной массы НР) в процессе фиксации и проводки биопсийного материала.

Применение кислых фиксаторов, например фиксатора Карнуа, обеспечивающих нерастворимость муцинов слизи, существенно не улучшает выявляемость инфекта.

Во - п е р в ы х, почти в трети случаев уплотненный слой слизи при обезвоживании ткани отслаивается (вследствие различной их плотности) и теряется.

Во - в т о р ы х, в уплотненном слое слизи (если он сохранился) при рутинных методах окраски очень сложно дифференцировать бактериальные тела. Для этих целей подходит только особо контрастная окраска типа серебрения.

Сопоставление цитологических препаратов, приготовленных различными способами, показало, что и crush-, и touch-способам присущи объективные недостатки, снижающие в конечном итоге качество и надежность диагностики НР-ин- фекции. При раздавливании биоптата на пред-

метном стекле, распределении его материала на площади около 2 см2 и удалении нераздавленных фрагментов (соединительная ткань) в препарате присутствует чрезвычайно много клеточных элементов в виде отдельных клеток и эпителиальных пластов, перекрывающих слизистые наложения. Поэтому поиск бактерий в подобном препарате осуществляется по периферии клеточных скоплений. Это требует особо тщательного просмотра препарата и больших затрат времени.

При отпечатке слизи с люминальной поверхности биоптата в цитологическом препарате оказывается очень мало материала для исследования. Слизь, как правило, не снимается полностью с поверхности слизистой оболочки, что существенно снижает надежность диагностики НР-инфек- ции. Качество диагностики этим способом страдает еще больше после проведения неадекватной эрадикационной терапии, когда популяция бактерий в слизи и на поверхности слизистой оболочки снижается, но не уничтожается.

С точки зрения надежности диагностики НРинфекции, наиболее приемлемым оказался brush- способ. При этом необходимо учитывать, что щеточное снятие слизи с поверхности слизистой оболочки в нескольких местах во столько же раз повышает диагностическую надежность.

Использовав несколько вариантов получения слизи и испытав их и в других клиниках, мы можем рекомендовать получение слизистых наложе-

Российский журнал

ний не менее чем в 4 участках каждого отдела желудка (малая и большая кривизна, передняя и задняя стенки). Необходимо, чтобы щеточка при каждом прикосновении погружалась в слизь до клеточной поверхности слизистой оболочки. После этого слизь стряхивается и сдвигается со щеточки на предметное стекло и распределяется на площади не более 1 см2.

С полученным препаратом можно поступить двояко. Если материал собирается от нескольких больных и диагностика отсрочивается на 1–2 сут, предметные стекла подсушивают на воздухе и хранят в холодильнике. В случае если диагностика осуществляется сразу, предметные стекла подсушивают и фиксируют над пламенем спиртовой горелки в течение 20–30 с на расстоянии не менее 10 см. После этого их окрашивают и изучают в световом микроскопе под иммерсией.

Для элективной окраски НР можно применять разнообразные тинкториальные методики, а также иммуноцитохимический метод. Однако при очевидных его преимуществах он пока малодоступен в практике. Однако и обычные методы окраски красителем Гимзы, акридиновым оранжевым, серебрение по Вартину–Старри и, конечно, по Граму [7] достаточно специфичны. Это подтвердили и результаты наших исследований.

Вместе с тем следует использовать и экспрессметоды окраски с доступными, дешевыми реактивами и с хорошей воспроизводимостью с минимальным числом артефактов. В результате сравнения различных способов мы пришли к выводу, что целесообразно использовать два из них: окраску мазков слизи 0,05% раствором акридинового оранжевого и по Граму. Для первого способа существуют два ограничения – отсутствие у исследователя люминесцентного микроскопа и кокковая форма бактерий.

Окраска акридиновым оранжевым (5 мг на 10 мл дистиллированной воды или физиологического раствора) осуществляется путем нанесения небольшой капли (15–20 мкл) на поверхность фиксированного мазка. Капля накрывается покровным стеклом, а избыток раствора по его краям отбирается фильтровальной бумагой. Через 1–2 мин препарат изучают в темном поле люминесцентного микроскопа под объективом с водной иммерсией. Бактерии специфической S-образной формы дают оранжевую флюоресценцию. Как мы уже упоминали, способ очень надежен для первичной диагностики и мало пригоден для оценки эрадикации.

По всем параметрам (простоте, специфичности, надежности, доступности реактивов и стоимости) способ окраски по Граму оказался наилуч-

шим. Даже после лечения блокаторами секреции HCl и антигеликобактерными препаратами подтверждена надежность способа при дифференциальной оценке вида кокковой микрофлоры.

При окраске по Граму цитологических препаратов для диагностики НР-инфекции есть особенности при приготовлении красителей и окрашивании, которые необходимо учитывать для достижения хорошего качества. Если обычно используется 1% раствор генцианили кристаллвиолета, то в нашем случае раствор должен быть 0,1% и окрашивание проводиться не 1 мин, а 20–30 с. После каждого красителя обязательно нужно ополаскивать препарат проточной водой и осушать фильтровальной бумагой или марлевым тампоном.

Оптимальный режим окраски цитологического препарата по Граму для диагностики НР-ин- фекции имеет следующий алгоритм:

–фиксировать препарат над пламенем, как указано выше;

–покрыть зону окрашивания фильтровальной бумагой и нанести на нее несколько капель 0,1% раствора генцианвиолета на 20–30 с;

–снять фильтровальную бумагу и промыть слабой струей проточной воды;

–осушить и налить на стекло несколько капель водного раствора Люголя на 2 мин;

–смыть раствор слабой струей воды и осушить;

–обесцветить в 2 сменах смеси спирта и ацетона (1:1) путем 4–5-кратного погружения в каждый;

–смыть проточной водой с двух сторон стекла и осушить;

–окрасить 0,1% водным раствором сафранина О в течение 2 мин;

–смыть краску проточной водой и окончательно высушить препарат.

Таким образом, для оптимизации цитологической диагностики инфекции Helicobacter pylori

иоценки ее эрадикации необходимо исследовать полученную brush-способом слизь, взятую не менее чем из 4 участков обоих отделов желудка.

Для повышения качества диагностики и снижения числа ложноположительных результатов при оценке эрадикации необходимо использовать окраску цитологических препаратов по Граму в предложенной нами модификации.

Отработанный и описанный в данной статье вариант приготовления цитологического препарата можно считать простым, быстрым, высокочувствительным, специфичным, дешевым и, что немаловажно, малоинвазивным методом диагностики инфекции Helicobacter pylori.

1.Carmona T., Minoz E., Del Mar Abad M. et al. Usefulness of antral brushing samples stained with

Diff-Quik in the cytologic diagnosis of

Helicobacter pylori. A comparative methodologic study // Acta Cytol. – 1995. – Vol. 39. – P. 669–672.

2.Debongnie J., Delmee M., Mainguet P. et al. Cytology: a symple, rapid, sensitive method in the diagnosis of Helicobacter pylori // Amer. J. Gastroenterol. – 1992. – Vol. 87. – P. 20–23.

3.Debongnie J., Donnay M., Mairesse J. Gastrospirillum hominis (H. heilmannii): a cause of gastritis, sometimes transient, better diagnosed by touch cytology? // Amer. J. Gastroenterol. – 1995. – Vol. 90. – P. 411–416.

4.Debongnie J., Mairesse J., Donnay M., Dekoninck X. Touch cytology. A quick, simple, sensitive screening test in the diagnosis of infection of the gastrointestinal mucosa // Arch. Pathol. Lab. Med. – 1994. – Vol. 118. – P. 1115–1118.

5.Libera M., Pazzi P., Carli G. et al. Brush cytology: a reliable method to detect Helicobacter

pylori // J. Clin. Gastroenterol. – 1996. – Vol. 22. – P. 317–321.

6.Misra S., Dwivedi M., Misra V., Gupta S.

Imprint cytology – a cheap, rapid and effective method for diagnosing Helicobacter pylori // Postgrad. Med. J. – 1993. – Vol. 69. –

P.291–295.

7.Montgomery E., Martin D., Peura D. Rapid diagnosis of Campylobacter pylori by Gram’s stain // Amer. J. Clin. Pathol. – 1988. – Vol. 90. –

P.606–609.

8.Rodriguez I., Saes de Santamaria J., Del Mar Alcide Rubio M. et al. Cytologic brushing as a simple and rapid method in the diagnosis of Helicobacter pylori infection // Acta Cytol. – 1995. – Vol. 39. – P. 916–919.