6 курс / Гастроэнтерология / Российский_журнал_гастроэнтерологии,_гепатологии,_колопроктологии (1)

Определение в сыворотке крови специфических антител классов IgG и IgA против Helicobacter pylori активно используется для скрининга и первичной

диагностики инфекции. По данным литературы, специфичность и чувствительность серологических методик по сравнению с комбинацией инвазивных методов, включающих бактериологическое исследование, составляет не менее 90–95% [4]. Однако существуют ограничения, затрудняющие использование серологических методов для контроля за лечением инфекции H. pylori.

Одно из наиболее важных ограничений связано с тем, что концентрация специфических антител против H. pylori снижается в крови пациентов, вылеченных от инфекции, продолжительный период. Установить ее значимое изменение с помощью стандартных методик удается после терапии, по данным разных авторов, в сроки от 3 до 6 мес, а иногда и более [3, 5, 6].

Суть проблемы состоит в том, что при оценке концентрации специфических антигеликобактерных антител в сыворотке крови больных с помощью стандартных наборов для иммуноферментного анализа (ИФА) ее исходное значение варьирует в значительных пределах, а снижение после эрадикации H. pylori имеет нелинейный характер.

Для решения этой проблемы в последнее время пытаются применять наборы с более высокой чувствительностью, позволяющие определять очень небольшие различия концентрации антигеликобактерных антител. Возможность применения одного из таких наборов для первичной диагностики и оценки эрадикации H. pylori была нами изучена.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом исследования явились сыворотка крови и биоптаты слизистой оболочки желудка, полученные от 80 больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки, инфицированных H. pylori, из которых 48 проводилась антигеликобактерная терапия в стационаре, а 32

– в поликлинике МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского. Сыворотку собирали до лечения, спустя 4 нед после окончания терапии, а у части больных (15) – дополнительно спустя 8 нед после лечения. В качестве серологического метода использовали набор для иммуноферментного анализа “HELCONS-AB IgG” производства фирмы “Consortia Lab.” (Италия).

Данный метод представляет собой вариант не-

Рис. 2. Динамика титров антигеликобактерных антител в зависимости от исхода эрадикационной терапии инфекции H. pylori

ние титра достоверно не изменилось – 137,2±28,6 и 141,2±32,1 мкг/мг.

Таким образом, определение эрадикации серологическим методом и инвазивными методиками через 4 нед после окончания терапии совпало в 95,5±2,5% случаев (у 64 из 67 больных), отсутствие эрадикации – в 92,3±7,7% (у 12 из 13).

Дополнительное исследование сыворотки через 8 нед после окончания терапии показало, что у всех 15 больных с эрадикацией продолжилось снижение титра антител. Так, у тех 3 больных, у которых через 4 нед после терапии снижение титра не достигло 20% порога, через 8 нед после лечения он снизился более чем на 40% по сравнению с исходным значением. Титры же инфицированных больных остались без изменения или незначительно повысились.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Продолжительное время серологический метод использовался исключительно для первичной диагностики инфекции H. pylori. Связано это было с тем, что концентрация специфических антигеликобактерных антител снижалась до значений, расцениваемых как отсутствие инфекции через значительный промежуток времени – от 3 до 6 мес, а у отдельных больных – через 12 мес после удачного лечения инфекции H. pylori.

Позднее, когда в качестве критерия эрадикации стали использовать изменения титра специфических антигеликобактерных антител, то оказалось, что снижение титра на 40% от исходного в 100% случаев совпадает с эрадикацией H. pylori при использовании стандартного набора для ИФА [5].

Различными авторами показано, что при использовании такого подхода и обычных коммерческих наборов для ИФА можно диагностировать эрадикацию более чем у 90% больных уже к

Российский журнал

3-му месяцу после лечения, несмотря на то что серонегативность у всех вылеченных больных наступила только через 12 мес [7]. Однако такие сроки определения эрадикации существенно превышают стандартные 4–6 нед после лечения, по истечении которых обычно оценивают результаты лечения инвазивными методами или с помощью дыхательного теста.

Объективными причинами, которые мешали пользоваться обычным ИФА в указанные сроки, были колебания общего содержания IgG в крови больных, которые нивелировали минимальные изменения уровня специфических антигеликобактерных IgG, а также значительная вариабельность концентрации специфических IgG в крови больных до лечения, что затрудняло разработку и использование универсального протокола для оценки результатов лечения инфекции H. pylori с помощью серологического метода.

Так, при использовании стандартных наборов для ИФА при оценке эрадикации H. pylori у больных с высоким исходным значением концентрации антигеликобактерных антител ее снижение происходит быстрее, чем у пациентов с исходно низкими значениями [5]. Это обстоятельство затрудняет применение метода и требует использования дифференцированной оценки результатов анализа у больных с различным исходным уровнем антител или удлинения сроков повторного обследования.

Использование высокочувствительных вариантов ИФА, таких, как в нашем исследовании, позволяет либо устранить, либо свести к минимуму все эти недостатки. Все значения оптической плотности исследованных проб варьировали в пределах калибровочной кривой. Это свидетельствует о высокой воспроизводимости метода.

Самое главное – принцип метода позволяет практически избежать получения сомнительных результатов. У 3 (4,5±2,5%) больных с эрадикацией H. pylori снижение титра менее чем на 20% через 4 нед после лечения и его значительное снижение через 8 нед отражает, по-видимому, нелинейный характер снижения концентрации антител. При использовании стандартных наборов для ИФА этот показатель составляет около 50% [7].

Как видно из результатов нашего исследования, у 95,5±2,5% больных удается диагностировать эрадикацию в контрольные сроки (через 4 нед), а у оставшихся – через 8 нед. Наблюдения же за больными, у которых эрадикации достичь не удалось, показали, что у них колебания титров не превышают 5% от исходного. Столь стабильные титры выявляются во время всего периода наблюдения.

Учитывая полученные нами данные, можно с уверенностью сказать, что серологическая диагностика эрадикации H. pylori через 4 нед после окончания антигеликобактерной терапии возможна при использовании указанного варианта иммуноферментного анализа.

1.Аруин Л.И., Исаков В.А. Метод оценки обсемененности слизистой оболочки желудка Helicobacter pylori // Арх. пат. – 1995. – № 3.

– C. 75-76.

2.Григорьев П.Я., Исаков В.А., Розенталь В.М. и др. Метод определения Campylobacter pylori в слизистой оболочке желудка при язвенной болезни и хроническом гастрите // Лаб. дело. – 1989. – № 6. – C.52–54.

3.Cutler A., Prasad V. Long-term follow-up of Helicobacter pylori serology after successful eradication // Amer. J. Gastroenterol. – 1996. – Vol. 91. – P. 85–88.

4.Glupczynski Y. Microbiological and serological diagnostic tests for Helicobacter pylori: an

overview // Acta Gastroenterol. Belg. – 1998. – Vol. 61. – P. 321–326.

5.Lerang F., Haug J.B, Moum B. et al. Accuracy of IgG serology and other tests in confirming Helicobacter pylori eradication // Scand. J. Gastroenterol. – 1998. – Vol. 33. – P. 710–715.

6.Perez-Perez G.I., Cutler A.F., Blaser M.J. Value of serology as a noninvasive method for evaluating the efficacy of treatment of Helicobacter pylori infection // Clin. Infect. Dis. – 1997. – Vol. 25.

– P. 1038–1043.

7.Sorberg M., Engstrand L., Strom M. et al. The diagnostic value of enzyme immunoassay and Immunoblot in monitoring eradication of Helicobacter pylori // Scand. J. Infect. Dis. – 1997. – Vol. 29. – P. 147–151.

За счет повышения концентрации водородных ионов достоверно увеличивался и дебит соляной кислоты: соответственно 0,786 и 0,539 ммоль (р<0,05). В последующих трех базальных порциях достоверных различий не выявлено. В ответ на введение субмаксимальной дозы гистамина у детей с ДГР содержание водородных ионов повысилось более значительно, чем у больных без наличия ДГР: соответственно 31,205 и 17,308 ммоль/л (р<0,05).

Желудочное содержимое включает в себя слюну и секрет желудочных желез. При ДГР часть содержимого двенадцатиперстной кишки попадает в желудок. В результате увеличивается объем желудочного содержимого и затрудняется эвакуация из желудка. По системе обратной связи информация об избыточном объеме желудочного содержимого передается в слюнные железы, и выработка секрета снижается.

Вэксперименте доказано, что снижение рН слюны приводит к уменьшению секреции слюнных желез, а при рН 6,0 секреция вообще прекращается. Но по мере увеличения рН до 7,5 и более скорость секреции возрастает почти линейно [2]. Этим механизмом можно объяснить более низкий рН слюны у больных с ДГР по сравнению

сpH у больных без ДГР: соответственно 7,369 и 7,529 (р<0,05), что подтверждает данные экспериментальных исследований.

Более высокая концентрация ионов кальция в тощаковой и особенно в первой порциях желудочного содержимого у детей с ДГР по сравнению ее у детей без ДГР можно объяснить забросом дуоденального содержимого, богатого ионами кальция. По нашим данным, концентрация кальция в дуоденальном содержимом на порядок выше, чем в желудке, и колеблется от 38 до 81 ммоль/л. У больных с ДГР в тощаковой порции содержится 6,884±1,2 ммоль/л кальция, а без ДГР – 3,223 ммоль/л (р<0,05). Увеличение концентрации ионов кальция в желудочном содержимом приводит к более интенсивному выбросу ионов водорода обкладочными клетками [1].

Вответ на введение гистамина у детей с ДГР концентрация ионов водорода в первые 15 мин повышается более значительно, чем у больных без ДГР: соответственно 31,205 и 17,308 ммоль/л (р<0,05). Затем показатели в обеих группах выравниваются, и значительных различий в последующих трех порциях нет.

Известно, что в отличие от гастринового и вагусного механизмов гистамин воздействует на

Н2-рецепторы париетальных клеток без участия ионов кальция. При избытке ионов кальция у больных с ДГР в основном задействованы Ca++- зависимые механизмы, и при введении гистамина реакция обкладочных клеток более активна, чем

у больных без ДГР.

Увеличение дебита Н+ в первой порции у больных с ДГР по сравнению с дебитом у детей без ДГР объясняется более высокой концентрацией

Н+, так как по объему первой порции обе группы не отличались.

Мы исследовали содержание ионов в слюне у 14 детей с гастроэзофагеальным рефлюксом

(ГЭР). При ГЭР рН слюны значительно ниже, чем у больных без ГЭР. Если у детей с ГЭР рН слюны составляет 7,267, то у больных без ГЭР – 7,477 (р<0,05).

В отличие от содержания ионов водорода концентрация ионов калия в слюне ниже у больных с ГЭР, чем у детей без ГЭР: соответственно 32,237 и 55,763 ммоль/л (р<0,05). Аналогично и содержание ионов перхлората: у больных с диагностированным ГЭР содержание перхлората в слюне составило 27,37 мкмоль/л, а в группе больных без ГЭР – 50,90 мкмоль/л (р<0,05).

При сравнении ионного состава тощаковой порции желудочного содержимого у детей с ГЭР и без ГЭР достоверной разницы в концентрации ионов не обнаружено.

Учитывая достоверные различия рН, концентрации ионов калия и перхлората в слюне у больных с ГЭР и без ГЭР, мы проанализировали возможность использования этого различия в качестве неинвазивного косвенного диагностического признака ГЭР. Доверительный интервал, или 95% уровень надежности, для рН у детей с ГЭР равен 7,267±0,166, то есть между значениями рН 7,101 и 7,433, а у больных без ГЭР – 7,477±0,070 (7,407–7,547). Показатели обеих групп «накладываются» (пересекаются).

Подобная картина наблюдается и с ионами перхлората. У детей с ГЭР концентрация ионов колебалась в пределах 16,371–38,369 мкмоль/л, а у больных без ГЭР – 30,602–71,198 мкмоль/л. В отличие от содержания ионов водорода и перхлората концентрация ионов калия в слюне имела различный диапазон доверительных интервалов. У детей с ГЭР концентрация калия составила 32,237 ммоль/л с доверительным интервалом ±6,153 (26,08–38,39 ммоль/л), а у больных без ГЭР – 55,763 ммоль/л с доверительным интервалом ±10,43 ммоль/л (45,33–66,193 ммоль/л). Показатели доверительных интервалов не “накладываются” (не пересекаются).

При сопоставлении содержания ионов в слюне видно, что у больных с ГЭР в слюне концентрация ионов водорода большая (рН 7,267 и 7,477, р<0,05), меньшее содержание ионов калия (32,237 и 55,763 ммоль/л, р<0,05) и перхлората (27,370 и 50,9 мкмоль/л, р<0,05), чем у детей без ГЭР. По-видимому, заброс содержимого желудка в пищевод приводит к подкислению и слюны, более высокий уровень ионов водорода тормозит функцию Na+, K+, 2Cl–-котранспортной системы [3], что уменьшает секрецию слюны и усугубляет повреждающее действие желудочного содержимого на слизистую оболочку пищевода.

При сравнении содержания ионов в слюне и тощаковой порции желудочного содержимого у 10 больных с двойным рефлюксом (ДГР + ГЭР)

Российский журнал

Полиповидные образования слизистой оболочки желудка (СОЖ) возникают в результате дисрегенерации на фоне хронического ее воспаления, сопро-

вождающегося атрофическими изменениями [8, 19]. Однако до настоящего времени не раскрыт характер дисрегенераторных изменений эпителия, являющихся основой формирования желудочных полипов. Общеизвестна приоритетная роль Helicobacter pylori (HP) в развитии воспа- лительно-дисрегенераторных изменений СОЖ [18]. Несмотря на это, особенности колонизации

НР поверхности полиповидных выпячиваний желудка и СОЖ при фоновом хроническом гастрите (ФХГ) остаются неопределенными. Хотя в последние годы убедительно доказана модулирующая роль внеклеточного матрикса при дисрегенераторных и опухолевых процессах [10, 14], его структура в полипах желудка и СОЖ при ФХГ изучена мало.

Цель исследования состояла в изучении и сравнении морфологии гиперпластических, аденоматозных полиповидных образований желудка, фонового хронического гастрита, выяснении

условий для полипообразовательного процесса, установлении возможной роли HP в развитии полипов СОЖ.

Изучены биоптаты полипов желудка и СОЖ, прилежащей к полипозным образованиям в радиусе 3 – 4 см, взятые у 181 эндоскопически обследованного больного в Челябинском областном диагностическом центре. Полипы были распределены на группы в соответствии с классификацией K. Elster [16]: фовеолярная гиперплазия (ФГ) диагностирована у 101 больного, гиперпластические полипы (ГП) – у 66, «двухэтажные» аденомы (ДА) – у 6, аденомы желудка – у 8.

Фиксацию, проводку и заливку материала осуществляли по общепринятой схеме. Плоскопараллельные серийные тканевые срезы окрашивались гематоксилином и эозином, реактивом Шиффа, альциановым синим, пиронином по Браше, пикрофуксином по ван Гизону, азотнокислым серебром по Гомори. Активность районов ядрышковых организаторов эпителиальных клеток определяли в гистологических препаратах, окрашенных 50% коллоидным раствором азотнокислого серебра. Количество и характер распределения аргирофильных белков, ассоциированных с зонами ядрышковой транскрипции (NORAPs), оценивали по методу J. Croker et al. [15].

Морфологическую идентификацию коллагенов I, III, IV, V типов и фибронектина проводили на парафиновых тканевых срезах непрямой иммунопероксидазной реакцией с использованием моноклональных антител. Фукомуцины и сиаломуцины выявляли с помощью специфических флюоресцеинизотиоцианатмеченных (ФИТЦ-мечен- ных) лектинов лядвинца и мечехвоста. Объемное содержание эпителиальной ткани, стромы, просветов желез и ямок, коллагенов и фибронектина при ФХГ и полипах желудка устанавливали планиметрическим методом точечного счета Г.Г. Автандилова и соавт. [1].

При морфологическом исследовании СОЖ вне полипов во всех случаях (100%) был верифицирован хронический гастрит с явлениями атрофии различной степени выраженности, что совпадает с результатами других исследователей [13, 19]. ФХГ с начальными явлениями атрофии выявлен у 72,3% больных, с умеренными

–у 27,7%.

При ФХГ наблюдались неравномерное сниже-

ние высоты и содержания желез СОЖ, удлинение и штопорообразная извитость ямок. Покровный и ямочный эпителий характеризовался малой степенью дифференцировки, низкой слизепродуцирующей активностью, незначительным представительством в цитоплазме нейтральных мукополисахаридов и гликопротеидов, высоким содержанием РНК, фукомуцинов, представительным числом ядрышек, интрануклеолярных и внутрикариоплазменных NORAPs, наличием небольшого количества кислых мукополисахаридов и сиаломуцинов.

Российский журнал

Волокнистый каркас СОЖ при ФХГ в основном был представлен фуксинофильными, ретикулярными волокнами, коллагенами I, III, IV и V типов и фибронектином. Эластические волокна выявлялись в незначительном количестве (рис. 1 а – о).

ФГ и ГП имели сходное строение (рис. 2 а – г). Они характеризовались гиперплазией желудочных ямок, высокой степенью дифференцировки покровного и ямочното эпителия, выраженной его способностью к продукции слизи, значительным содержанием в цитоплазме эпителиоцитов нейтральных мукополисахаридов, гликопротеидов, фукомуцинов, низким содержанием РНК, ядрышек и NORAPs при отсутствии кислых мукополисахаридов и сиаломуцинов.

Волокнистый компонент стромы гиперпластических образований преимущественно состоял из ретикулярных волокон, образующих сетчато-пет- листый каркас, а также коллагенов I, III, IV и V типов и фибронектина. Фуксинофильные и эластические волокна имели незначительное представительство.

Отличительной особенностью аденомы желудка была дисплазия ее паренхимы. Диспластически измененный эпителий аденомы имел признаки нарушенной дифференцировки. Он характеризовался низкой слизеобразующей активностью, крайне малым представительством в его цитоплазме полисахаридов, фуко- и сиаломуцинов, значительным содержанием РНК, ядрышек и NORAPs, умеренным содержанием кислых мукополисахаридов. Во внеклеточном матриксе аденомы при значительном представительстве ретикулярных волокон, коллагена III типа, низком – фуксинофильных и эластических волокон, коллагенов I, IV и V типов регистрировалась отрицательная реакция на фибронектин (рис. 2 и – м).

ДА имели смешанное строение, проявлявшееся диспластическими изменениями в верхних слоях слизистой оболочки этих полипов и наличием железистых структур, типичных для ГП в глубоких отделах (рис. 2 ж, з).

Умеренная и выраженная НР-обсемененность в большей степени была свойственна ФГ и ГП, чем фоновому гастриту, а слабая и нулевая – ФХГ, р<0,05 (табл. 1). Это, вероятно, может являться свидетельством возможной роли геликобактерий в возникновении очаговых гиперпластических изменений СОЖ. Высокая локальная НР-обсемененность, по всей видимости, определяет выраженную альтерацию СОЖ с интенсификацией образования арахидоновой кислоты и ее метаболита – простагландина Е2 [11], который, по мнению H.F. Helander et al. [17] и A. Uribe et al. [20], индуцирует цАМФ-опосредо- ванную очаговую гиперплазию СОЖ.

Умеренная и высокая степени активности хронического воспаления чаще встречались при ФГ и ГП, чем при ФХГ. Для фонового же гастрита в сравнении с гиперпластическими образованиями

более характерной являлась слабая и нулевая активность воспаления, р<0,05 (табл. 2). Значительное и умеренное представительство стромальных фуксинофильных телец (Русселя) также в большей степени было свойственно ФГ и ГП, а малое и нулевое – ФХГ (р<0,05).

Более интенсивная НР-обсемененность гиперпластических разрастаний в сравнении с ФХГ, по-видимому, связана с более высокой слизеобразующей способностью гиперпластически измененной СОЖ, поскольку масса желудочной слизи является фактором защиты HP [3]. Более высокая HP-колонизация поверхности ФГ и ГП, чем СОЖ при ФХГ, вероятно, определяет выраженную альтерацию их слизистой оболочки, интенсивную иммуновоспалительную ее реакцию с высокой наклонностью к обострению хронического воспаления [4,5], сопряженной с образованием и накоплением в строме телец Русселя [9].

Интенсивность HP-колонизации, степень выраженности активности хронического воспаления, представительство телец Русселя при атрофическом фоновом гастрите, «двухэтажных» и аденоматозных полипах были сравнительно незначительными и между собой не различались. Невысокая степень НР-обсемененности при аденоматозных образованиях и ФХГ, вероятно, связана с низким слизеобразующим потенциалом дисплазированного эпителия аденом и малодифференцированного эпителия при фоновом гастрите. Низкая плотность HP-колонизации при аденоме и ФХГ определяет слабое повреждение СОЖ и незначительную напряженность ее иммунного воспаления.

Эрозии слизистой оболочки ГП встречались в 62,5% случаев (рис. 2 е), при ФХГ – в 1,7% и были несвойственны для аденом. При ГП и ДА постоянно выявлялась кистозная дилатация ямок, в 77,6% и 5 случаях соответственно – кисты (рис. 2 д), что было несвойственно для ФХГ. Различная частота встречаемости эрозивных дефектов, кист при ФХГ и полипах желудка, вероятно, связана с неодинаковой интенсивностью НР-обсемененности и сопряженной с ней активностью воспаления [4,9].

Частота встречаемости кишечной метаплазии СОЖ как при ФХГ, так и при гиперпластических разрастаниях была представительной и примерно равной (29,1 и 23,9% соответственно), что согласуется с данными других авторов [7].

Объемное содержание эпителия, количество ямочных и железистых просветов при ФХГ уступало таковым в ФГ, ГП, ДА, аденоме. Представительство стромы в СОЖ при фоновом гастрите было выше по сравнению с гиперпластическими и аденоматозными разрастаниями (рис. 3). Это является ярким свидетельством содружественного характера изменений эпителия и стромы при хроническом гастрите и гиперплазиогенных полиповидных образованиях, возникновения и

прогрессирования разобщения эпителиальностромальных взаимоотношений в «двухэтажных» и аденоматозных полипах.

Среднее количество NORAPs и ядрышек в покровном эпителии, содержание активно пролиферирующих эпителиальных клеток II типа при ФХГ преобладало над таковым при воспалитель- но-гиперпластических образованиях СОЖ. Количество покоящихся эпителиоцитов I типа в слизистой оболочке ФГ и ГП превышало его при ФХГ. Представительство NORAPs и ядрышек в эпителии, эпителиоцитов II типа в «двухэтажных» и аденоматозных полипах было значительно выше, чем при ФХГ, а клеток I типа меньше (рис. 4, 5).

Высокое содержание NORAPs в эпителиоцитах и значительное представительство клеток II типа в СОЖ при ФХГ в сравнении с гиперпластическими разрастаниями свидетельствует о высоких темпах обновления покровного эпителия, свойственного хроническому гастриту, при котором интенсивная репликация клеток генеративной зоны с их транслокацией на поверхность СОЖ уравновешивается ускоренной экструзией эпителиоцитов [3].

Незначительное представительство NORAPs в эпителии, низкий удельный вес числа эпителиоцитов II типа, высокое содержание клеток I типа при ФГ и ГП по сравнению с ФХГ, ДА и аденомой говорят о низкой пролиферативной активности эпителиальных клеток, замедленном темпе клеточного обновления. Это подтверждает мнение Л.И. Аруина [2] о том, что основой возникновения гиперпластических изменений СОЖ являются очаговое замедление обновления эпителия, низкая скорость его миграции, задержка экструзии и апоптоза.

Неуклонно возрастающее увеличение среднего количества NORAPs, нарастание содержания эпителиоцитов II типа, снижение представительства эпителиальных клеток I типа при ДА и аденоме в сравнении с ФХГ, ФГ и ГП являются свидетельством прогрессирующего нарастания темпов пролиферации диспластически измененного эпителия на разных этапах развития опухолевого процесса в СОЖ.

В целом активность районов ядрышковых организаторов в покровном и ямочном эпителии при хроническом гастрите и гиперпластических полиповидных образованиях отражает различные формы дисрегенерации СОЖ при прогрессировании в ней хронического воспаления. Нарастание интенсивности транскрипционной активности в эпителиальных клетках «двухэтажных» и аденоматозных полипов следует считать эквивалентом прогрессирующего нарушения регуляции роста и дифференцировки, отражающего стадийный характер развития опухоли.

Объемное представительство коллагенов I, III, IV и V типов и фибронектина при ФХГ преобладало над таковым при ФГ, ГП, ДА и аденоме. В

Российский журнал