2.2.1. Специфические реактивы для получения биуретового реактива

1. Натрия хлорид, ч.д.а. или х.ч.,154 ммоль/л (изотонический раствор);

2. Натр едкий, ч.д.а или х.ч.,0,2 моль/л;

3. Калия йодид, ч.д.а. или х.ч., 30 ммоль/л раствор йодида калия в 0,2 моль/л растворе едкого натра;

4. Калий-натрий виннокислый 4-водный (сегнетова соль);

5. Меди сульфат 5-водный ч.д.а. или х.ч.;

2.2.2. Подготовка к анализу.

В связи с тем, что срок хранения рабочего раствора биуретового реактива ограничен 14 днями, его готовят непостредственно перед серией экспериментов в достаточном количестве из биуретового реактива.

Приготовление биуретового реактива: 4,5 г сегнетовой соли растворяют в 40 мл 0,2 моль/л едкого натра, прибавляют 1,5 г сульфата меди и 0,5 г йодида калия и растворяют. Доливают до 100 мл 0,2 моль\л раствором едкого натра.

Приготовление рабочего раствора биуретового реактива: 20 мл биуретового реактива смешивают с 80 мл 0,5 % раствора йодида калия.

3. Методика эксперимента

Опытная проба: к 0,2 мл вытяжки прибавляют 5 мл рабочего раствора биуретового реактива и смешивают, избегая образования пены. Через 40 мин ( и не позднее чем через час ) измеряют оптическую плотность на ФЭК в

кювете с толщиной слоя 1 см, со светофильтром, имеющим длину 500-560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы. Холостая проба : к 5 мл рабочего биуретового реактива прибавляют 0,2 мл 154 ммоль/л раствора хлорида натрия.

2.2.4. Построение градуировочного графика.

Перед началом работы необходимо построить градуировочный график альбумина. Для этого мы приготовили серию разведений в пяти пробирках. В первую пробирку вносили 1 мл 10 %-го раствора альбумина, затем доливали до отметки 10 мл раствором натрия хлорида. Во вторую пробирку вносили 1 мл чистого альбумина из первой пробирки и приливали 1 мл натрия хлорида (изотонического раствора). В третью пробирку вносили 1 мл из второй пробирки и приливали 1 мл натрия хлорида. Аналогично поступили с четвертой и пятой пробиркой, получая тем самым 1%, 0,5%, 0,25%, 0,125%, 0,075 % растворы.

В каждую из 5 пробирок вносили пипеткой по 0,2 мл вытяжки из каждого разведения и приливали по 5 мл рабочего биуретового реактива и смешивали, избегая образования пены.

Для того, чтобы определить динамику показаний результатов проведенного анализа в зависимости от времени, мы провели серию экспериментов, в которой показания оптической плотности снимались каждую минуту в течении часа. Полученные нами данные представлены в таблице 2.1.

Таблица 2.1

Изменение показаний оптической плотности альбумина в зависимости от времени

Время, мин.	Оптическая плотность	Время, мин.	Оптическая плотность
01	0,826	31	0,869
02	0,832	32	0,870
03	0,834	33	0,869
04	0,833	34	0,871
05	0,835	35	0,873
06	0,835	36	0,872
07	0,837	37	0,871
08	0,840	38	0,873
09	0,842	39	0,874
10	0,840	40	0,875
11	0,843	41	0,873
12	0,845	42	0,874
13	0,845	43	0,874
14	0,846	44	0,875
15	0,848	45	0,874
16	0,850	46	0,873
17	0,851	47	0,875
18	0,853	48	0,874
19	0,852	49	0,875
20	0,855	50	0,874
21	0,860	51	0,874
22	0,862	52	0,875
23	0,861	53	0,875
24	0,860	54	0,874
25	0,863	55	0,875
26	0,864	56	0,874
27	0,863	57	0,874
28	0,865	58	0,874
29	0,867	59	0,874
30	0,868	60	0,874

Рис. 1. Определение временной стабильности показаний оптической плотности альбумина.

На рисунке №1 наглядно показана динамика изменения показаний оптической плотности во времени. Видно, что показания оптической плотности растут до 40 минуты, а после показания стабилизируются и рост прекращается. Следовательно, мы сделали вывод, что измерения исследуемых образцов следует проводить через 40 мин после приготовления пробы.

Затем измеряли оптическую плотность на ФЭК в кювете с толщиной слоя 1 см, со светофильтром, имеющим длину 500-560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы. Холостая проба : к 5 мл рабочего биуретового реактива прибавляют 0,2 мл 154 ммоль/л раствора хлорида натрия. Оптическую плотность в каждом растворе мы измеряли по 5 раз и из полученных данных брали среднее арифметическое значение.

Данные для построения калибровочного графика альбумина представлены в таблице 2.2.

Таблица 2.2.

Зависимость величины оптической плотности от концентрации альбумина в растворе.

Концентрация белка; %	Повторность					Среднее значение оптической плотности	Доверит. интервал
	1	2	3	4	5
1	0,872	0,871	0,876	0,877	0,873	0,874	0,02
0,5	0,473	0,475	0,476	0,473	0,475	0,474	0,03
0,25	0,237	0,238	0,238	0,232	0,235	0,236	0,015
0,125	0,111	0,112	0,109	0,111	0,112	0,111	0,01
0,075	0,050	0,051	0,049	0,053	0,050	0,050	0,023

По полученным данным построили график зависимости величины оптической плотности от концентрации альбумина в растворе.

Рис.2. Калибровочный график для определения концентрации альбумина.

На данном графике видно, что при увеличении концентрации альбумина в растворе показатели оптической плотности линейно возрастают. Максимальное значение = 0,874, минимальное = 0,050.

Настоящая методика обеспечивает выполнение измерений содержания белка исследуемого образца с погрешностью, не превышающей 5% во всем диапазоне измеряемых величин при доверительной вероятности 0,95.

При помощи полученного уравнения, вычисляется значение концентрации белка в исследуемых образцах хлеба. Для этого измеряются показания оптической плотности для каждой пробы в пяти повторностях и для каждого рассчитываются их среднее арифметическое, которое подставляется в уравнение вместо «Х».

Из линейного уравнения с одной неизвестной определяется значение «У», которое соответствует значению концентрации белка исследуемого образца, найденному по градуировочному графику альбумина и умножается на коэффициент 10, для компенсации разведения объекта исследования при приготовлении пробы.