4.4. Диагностика

Диагноз ставят на основании эпизоотологических, клинических, патологоанатомических данных, результатов лабораторных исследований и биопробы на восприимчивых животных. Лабораторная диагностика предусматривает: выделение вируса в культуре клеток и иденти­фикация его в РН, обнаружение вирусного АГ в органах и тканях от павших и вынужденно убитых животных в РСК, РДП, ВИЭОФ, РТНГА, РНГА, РИФ, ИФА; обнаружение специ­фических AT у переболевших животных в РСК, РН, РДП, РТГА, ИФА. Разработан экс­пресс-метод диагностики болезни и видовой дифференциации морбилливирусов. Для этого используется ПЦР небольшого участка (430 п.н.) Р-гена с 389 по 821 н. в связи с тем, что нуклеотидная последовательность его 5'- и 3'- концов является достаточно консервативной, что позволяет унифицировать праймеры для всех морбилливирусов. С другой стороны, уча­сток, ограниченный этими праймерами, имеет достаточную степень вариабельности, что по­зволяет дифференцировать видовую принадлежность вируса. Нуклеотидная гомология амплифицированного участка Р-гена в парах ВЧ КРС - ВЧ МЖЖ, ВЧ КРС - ВЧС, ВЧ МЖЖ - ВЧС для исследованных штаммов составляет соответственно 66,67, 60,84 и 59,21%. Нуклеотидная гомология этого участка гена Р у вируса, выделенного от норок, с ВЧ КРС, ВЧП и ВЧ МЖЖ составила 60,84, 98,6 и 59,21% соответственно.

Выделение вируса. Взятие и подготовка материала. Материал для выделения вируса берут от больных (кровь, пунктат лимфоузлов) или убитых и павших животных (предлопаточные, мезентериальные лимфоузлы, селезенка). Патматериал берут в стерильную, плотно закрывающуюся посуду и доставляют в лабораторию нарочным в опечатанном термосе со льдом при строгом соблюдении мер предосторожности. Гепаринизированную кровь в стерильных условиях разливают по пробиркам и центрифугируют при 2500 мин^-1 15-20 мин. Образовавшийся слой лейкоцитов между эритроцитами и плазмой в форме суспензии или пленки переносят пастеровской пипеткой в стерильный флакон. Пленку лейкоцитов отмывают от эритроцитов питательной средой и измельчают. Суспензию лейкоцитов в питательной среде используют для заражения культуры клеток. Заражать последнюю можно и цельной кровью. Вирус от больных животных можно выделить прижизненно из пунктата предлопаточных лимфоузлов в инкубационный период за сутки до начала лихорадки, а затем на всем протя­жении болезни.

Лимфоузлы и селезенку можно хранить при -20°С в течение 60 дн, при -40°С - 6 мес, при 2-4°С - не более 7 дн. В кусочках размером 1-2 см, помещенных в 10%-ный NaCl, вирус сохраняется при 2°С 15-30 дн. Вируссодержащая цитратная кровь в условиях комнатной температуры сохраняет активность 4-6 дн, при 5°С - 1 нед, при 0°С - 3-4 нед. В лиофильно высушенном материале, находящемся в ампулах под вакуумом при -20°С, вирус выживает более 5 лет, а при 2-4°С - не менее 1 года. При лиофилизации в качестве стабилизатора в суспензию добавляют 2% глюкозы и 5% пептона.

Заражение культуры клеток. Используют культуру клеток почки телят, которую после удаления ростовой среды заражают, нанося на слой клеток суспензию лейкоцитов исследуе­мого животного или суспензию его органов. Для адсорбции вируса культуры выдерживают 2 ч при 37°С, после чего инокулят отсасывают и вносят питательную среду с 2,5% телячьей инактивированной сыворотки. За культурой наблюдают 9-18 дн. На положительный резуль­тат указывает ЦПЭ. При отсутствии ЦПЭ делают слепой пассаж. Обычно при изоляции ви­руса таким методом затрачивается 20-25 дн. Идентификацию проводят в РН.

Заражение восприимчивых животных. Рекомендуют заражать молодняк КРС или те­лят буйволов кровью или 10-20%-ной суспензией лимфоузлов, полученной от больных жи­вотных в первые 5 дн после заболевания. Животным вводят подкожно 10 мл исследуемого материала. Это неразбавленная кровь или 10-20%-.ная суспензия селезенки и лимфоузлов. На положительный результат указывает подъем температуры тела через 5 дн после зараже­ния и последующее развитие типичной картины болезни. Смертность очень высокая - около 90%. В случае выздоровления животных дополнительным критерием специфичности тече­ния болезни является рост уровня AT.

Индикация и идентификация вируса. Вирусоскопия. ЭМ и ИЭМ в практических условиях не применяются. Из экспресс-методов диагностики наибольшего внимания заслуживает применение гибридизационного зонда. С помощью его (точечной гибридизации) удается дифференцировать два родствен­ных морбилливируса - ВЧ КРС и ВЧ МЖЖ. Дифференциальная диагностика с помо­щью ДНК-зондов помогла идентифицировать вспышку чумы КРС среди популяции баранов в Индии.

Обнаружение специфических телец-включений. В зараженных культурах клеток в цитоплазме одиночных клеток и симпластов появляются сначала мелкие эозинофильные включения округлой формы со светлым ободком вокруг. С увеличением размеров симпла­стов растут объем и число цитоплазматических включений. Последние принимают много­угольную, продолговатую формы или форму кольца, охватывающего ядра симпластов; в ци­топлазме располагается до 10 включений. Вслед за появлением цитоплазматических вклю­чений в инфицированных клетках, в том числе и в симпластах, образуются внутриядерные оксифильные включения в количестве 2-4. Хроматиновая сеть ядра нарушается лишь вокруг включений. В некоторых случаях они занимают почти все ядро.

Биопроба. Идентифицировать ВЧ можно биопробой на иммунном и неиммунном скоте. Двух животных вакцинируют сухой вирусвакциной из шт.ЛТ (согласно утвержденному на­ставлению по применению препарата). Через 12 дн вакцинированных и двух невакциниро­ванных животных заражают испытуемым материалом (суспензия селезенки, лимфоузлов и крови). При наличии у невакцинированных животных специфической температурной реак­ции, клинических признаков и отсутствии таковых у иммунных животных биопроба счита­ется положительной. У заболевших или павших животных обнаруживают специфический АГ в РСК и РДП.

PH. Применяют качественную и количественную PH. Для установления специфичности вызываемых вирусом поражений клеток проводят качественную РН, а для определения ко­личества AT в сыворотке иммунных животных - количественную.

РСК. Применяют для прижизненной и посмертной диагностики чумы с целью выявле­ния АГ в гомогенатах лимфоузлов, селезенки, а также в инфицированной культуре клеток. При использовании РСК с целью идентификации вируса в культуре клеток в качестве спе­цифического и контрольного АГ используют культуральную жидкость с зараженной и неза­раженной культурами клеток.

Предложена упрощенная модификация РСК для определения растворимых АГ ВЧ КРС. АГ готовят из лимфоузлов или селезенки КРС, коз и кроликов. Отмечено, что АГ, подверг­нутые замораживанию - оттаиванию или ультразвуковой обработке, или осаждению сульфа­том аммония или сульфатом натрия, более активны.

Гипериммунные сыворотки для идентификации вируса готовят по методу Скотта. Кровь берут от кроликов, иммунизированных лапинизированным, авинизированным или ЛТ-вирусами. Такие сыворотки нужны для обнаружения испытуемого АГ в РСК. Положитель­ные сыворотки и соответствующие им контроли (нормальные сыворотки) получают на КРС в возрасте 12-18 мес. От них берут сыворотку до иммунизации (контрольная) и через 21 день после подкожной прививки 100 иммунизирующих доз (позитивная сыворотка). Такая сыворотка обычно в РН реагирует положительно в разведении 1:40 - 1:80. Полученную сы­воротку сохраняют при -20°С и используют в РСК и РН с испытуемым АГ в течение 4-6 мес. Диагностическую сыворотку для РСК получают также от кроликов, инфицированных, а затем гипериммунизированных ВЧ КРС.

РДП. Реакцию ставят по методу Оухтерлони. Выявление преципитирующего АГ ВЧ в органах больного КРС является ценным диагностическим тестом, поскольку этот АГ регу­лярно появляется в лимфоузлах больных животных, начиная с 1-го дня повышения темпе­ратуры. На 3-й день болезни он выявляется лишь у 50% больных. РДП, как и РСК, дает бы­стрый ответ (через 12-18 ч). Оптимальный срок для взятия проб - период от 4-6 дн после начала лихорадки до появления поражений во рту и диареи. Если нет животного в этой ста­дии болезни, рекомендуют брать образцы от погибшего животного. Для исследования при­годен материал даже от разлагающихся в течение 52 ч трупов, в качестве антител исполь­зуют гипериммунные сыворотки кроликов и КРС.

Заведомо положительные и отрицательные АГ, приготовленные соответственно от больных и здоровых животных, используют в РДП одновременно. Положительную преципитируюшую сыворотку получают от кроликов, иммунизированных инфицированными кро­личьими тканями. РСК, РДП, РН и РНГА являются специфичными и эффективными лабо­раторными методами выявления АГ и идентификации ВЧ КРС. Однако данные A. Prowost и др. показали, что аттенуированные штаммы ВЧ КРС в естественных условиях не сти­мулируют продуцирование преципитирующего антигена в тканях животных. Это может быть характерным признаком отличия вакцинного штамма от эпизоотического. В Иране в 1982 г. в зонах, где скот был вакцинирован, у привитых животных не обнаруживали образо­вание преципитирующего антигена. Поэтому в зонах систематической вакцинации скота против данной инфекции диагноз поставить сложно.

ВИЭОФ. Предложен вместо РДП для быстрой диагностики чумы КРС. В качестве ис­пытуемого АГ служит суспензия селезенки и лимфоузлов толстого кишечника КРС и овец, полученных во время вспышки болезни. ВИЭОФ проводят в 0,8%-ной агарозе на вероналовом буферном растворе с рН 8,6. Гипериммунную сыворотку помещают в лунки вблизи анода, исследуемый материал - вблизи катода. Пластины помещают в горизонтальную ван­ночку с охлажденным вероналовым буфером. Линии преципитации образуются через 45 мин при силе тока 6 мА. ВИЭОФ при обнаружении АГ в тканях павших животных он ока­зался в 4-16 раз чувствительнее РДП и позволяет получить результат в течение 40 мин.

РТГА. Разработана для экспресс-диагностики чумы КРС. Если исследуемый материал содержит вирус, анти-ГА связываются, а их отсутствие или нехватку можно потом выявить, исследуя сыворотку в РТГА с использованием гемагглютинина ВК. При отсутствии вируса в исследуемом материале количество AT остается неизменным. В этой реакции используют родство АГ ВЧ КРС и ВК. Особую ценность она имеет для диагностики случаев заболева­ния, вызванных штаммами с ослабленной вирулентностью.

ИФ. В качестве исследуемого материала используют мазки-отпечатки и гистологиче­ские срезы (селезенка, лимфоузлы, печень, слизистые оболочки ротовой полости и кишеч­ника) из органов и тканей больных животных или инфицированные этими материалами культуры клеток. Возможно применение непрямого ИФ для обнаружения специфического АГ. Четкие результаты получают в случаях, если ФИТЦ-конъюгат изготовлен на основе гамма-глобулина, выделенного ионообменной хроматографией из специфической сыворот­ки. Прямая ИФ позволяет обнаруживать АГ в более ранние сроки: в мазках-отпечатках из органов больных животных через 2 ч, в зараженной культуре клеток - на 1 пассаж ранее по­явления ЦПД - т.е. раньше на 8-10 дн. С помощью прямой ИФ возможно оценивать результаты РН в культуре клеток через 24-48 ч после постановки опыта, тогда как для оцен­ки реакции по ЦПД вируса требуется 6-8 сут. Поэтому прямой метод ИФ признан высоко­специфичным, чувствительным и пригодным для экспресс-диагностики чумы КРС.

РНГА и РЗГА. Обе реакции позволяют дифференцировать сыворотки и АГ при исполь­зовании обработанных дубильной кислотой эритроцитов крови коз. Реакции основаны на адсорбции перекрестных AT из сыворотки, которая используется в РТГА.

ИФА. ИФА позволяет быстро выявлять АГ ВЧ КРС в патматериале. Наиболее часто АГ выявляли в мазках из поражений слизистой ротовой полости и лимфоузлов. АГ ВЧ наибо­лее часто выявляли у КРС моложе 3 лет, а у буйволов - в более старшем возрасте. В РДП и ИФА результаты совпадали, но последний позволял получить результат через 2-3 ч. Успеш­но вирус определяли в назальных и глазных секретах через 4 дн несмотря на то, что он там содержался в количестве не более 1,75 lg ТЦД₅₀/мл. ИФА оказался более чувствительным по сравнению с выделением ВЧ КРС. Получены компоненты набора для диагностики чу­мы КРС методом твердофазного ИФА, которые обеспечивают обнаружение вирусспецифического АГ (нуклеопротеина) ВЧ КРС в лизатах зараженных клеточных культур и пробах органов больньгх животных, а также обеспечивали обнаружение AT в сыворотках больных и переболевших животных. Чувствительность ТФ ИФА при выявлении специфических анти­тел в сыворотках крови больных и иммунных животных (метод ингибирования) сравнима с чувствительностью РТНГА с использованием эритроцитарного диагностикума на основе монАТ к ВЧ КРС.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. Для обнаружения AT используют РН, ВИЭОФ, РРГ и ELISA. Для серологического исследования берут кровь как можно раньше после установления клинических проявлений и повторно через 10-14 дн. Исследуют парные сыворотки крови не менее чем от 10 животных. ВНА и КСА у животных-реконвалесцентов обнаруживаются через 3-5 дн, поэтому чаще всего применяют РСК и РН. Ретроспективную диагностику чумы КРС проводят в очагах инфекции или при атипичном её течении на вакцинированном поголовье животных, имевших слабый поствакцинальный иммунитет. 4-кратное увеличение титра КСА и ВНА свидетельствует о наличии прошедшей инфекции.

РСК. Применяют чаще всего. На 3-4-й день после снижения температуры у животных обнаруживают КСА в титре от 1:10 до 1:40. На 21-30-й дн достигают максимума и удержи­ваются в течение 3 мес на уровне 1:80-1:160. Через 8 мес титр их составляет 1:20-1:40.

PH. Можно ставить на кроликах, имея лапинизированный штамм. Учитывая дорого­визну этого метода, его используют крайне редко. Реакция в культурах клеток с использова­нием адаптированных к ним штаммов - метод более простой и дешевый. Для выявления и титрования ВНА метод микротитрования не уступает пробирочному, но выгодно отличается от него меньшей чувствительностью к колебаниям дозы. Чтобы избежать цитотоксического и ингибирующего проявления, рекомендуется делать первоначальное разведение сыворотки 1:5. Количественную РН можно проводить в двух вариантах: 1) с постоянной дозой вируса (200-500 ТЦД₅₀) и двукратно возрастающими разведениями сыворотки; 2) с постоянной до­зой сыворотки (разведение 1:5-1:10) и 10-кратными разведениями вируса 10^-1-10^-6.

РТГА. В качестве АГ в этой реакции используют вирус кори.

ELISA. Непрямой твердофазный микрометод позволяет обнаруживать AT к ВЧ КРС. Данные его коррелируют с результатами РН. Считают, что указанный метод можно успешно применять для оценки эпизоотической ситуации и при проведении кампаний по вакцинации животных.

Проведена сравнительная оценка эффективности использования ИФ, ИФА и ВИЭОФ для выявления AT против чумы КРС у телят, вакцинированных культуральной вирус-вакциной против чумы КРС. Исследования проведены с использованием первичных куль­тур бычьей почки, выращенных на покровных стеклах и инфицированных шт.К90 ВЧ КРС, или с использованием мазков-отпечатков ткани лимфоузлов КРС, зараженного шт.Гиссар. При применении ИФА мазки-отпечатки предварительно обрабатывали антипероксидазной сывороткой для удаления эндогенной пероксидазной активности клеток лимфоузлов. Уста­новлено, что в первые 7 нед после вакцинации у телят удавалось выявить AT в 100% случа­ев всеми испытуемыми методами. В последующий период (с 8 до 12 нед после вакцинации) наиболее эффективным был метод ИФ (AT выявлены у 84,6-100% телят). Менее чувстви­тельными в этот период были методы ИФА и ВИЭОФ (соответственно AT обнаружены у 23-77,7 и 7,7-77,7% телят). Для определения AT к ВЧ КРС в Индии успешно применяют ме­тод microELISA. Показаны преимущества конкурентного ELISA со специфическими монАТ над непрямым ELISA.

Реакция радиального гемолиза (РРГ). Рекомендована для обнаружения AT к ВЧ КРС. В качестве АГ используют суспензию лимфоузлов от зараженных телят. Реакцию ста­вят на пластинках, куда вносят 2-4 мл 1%-ной агарозы с 0,3 мл конъюгированных с АГ ба­раньих эритроцитов, обработанных хлоридом хрома и 0,3 мл неразведенного комплемента.

Дифференциальная диагностика. Проводится по данным исследования вируссодержащего материала (гибридизационным тестом, биопробой, серологическими реакциями с видоспецифической сывороткой). В связи с тем, что в некоторых странах, в том числе и в европейских, чума КРС давно ликвидирована, при случайном заносе она может быть оши­бочно диагностирована как вирусная диарея или злокачественная катаральная горячка, что необходимо иметь в виду при дифференциальной диагностике чумы.