4.2. Характеристика возбудителя

Вирусную природу возбудителя болезни впервые установили Николь и др. в 1902 г.

Морфология и химический состав. Вирус чумы КРС и мелких жвачных в своей структуре имеет 6 белков (Н, F, L, N, Р и М), которые характеризуются высокой сте­пенью гомологии. Степень гомологии белка F ВЧ КРС и вируса кори (ВК) составляет 78,9%. По данным других авторов, гомология аминокислотных последовательностей белка F ВЧ КРС и ВК составляет 81,3%, а ВЧ КРС и ВЧС - 68,2%. Обнаружено АГ-родство Н- и особенно NP-белков ВЧ КРС, ВК и ВЧС. Нуклеотидная девергенция в гене НА аттенуированного штамма ВЧ КРС в 3-концевом некодирующем участке гена была более выра­женной, чем внутри кодирующей области. Гомология матриксного гена (кодирует бе­лок М) ВЧ КРС и ВК составляет 77,6%, а ВЧ КРС и ВЧС - 78,2%. Клонирован ген N-белка нуклеокапсида ВЧ КРС вирулентного шт.Kabet О и адаптированного к кроликам шт.L ВЧ КРС. При сравнении нуклеотидных последовательностей генов NB4 ВЧ КРС, ВК и ВЧС, установлено, что геном состоит из 1575 п.о. и кодирует N белок нуклеокапсида, со­стоящий из 575 остатков (мол.м. 59000 Д). По нуклеотидной последовательности кодирую­щей области этот ген ВЧ КРС (шт. К) гомологичен генам ВЧ КРС (шт.L), ВК и ВЧС соот­ветственно на 88,6, 68,9 и 63,2%.

Сконструирован рекомбинантный вирус ядерного полиэдроза Autographa californica, экспрессирующий N белок нуклеокапсида в клетках насекомых S19 и в личинках Spudaptera frugipezda. Рекомбинантный N белок использован в качестве покрывающего АГ в ИФА для того, чтобы отличить вакцинированных животных от животных инфицированных ВЧ КРС, а также для диагностики 2-х других морбилливирусов ВК и ВЧ. Неочищенного лизата одной инфицированной личинки достаточно для серологической диагностики 7200 образцов сыво­ротки. Н-ген у штамма К ВЧ КРС, кодирующий белок гемагглютинина, определяет вместе с белком А основные иммуннобиологические свойства этого вируса. При разра­ботке методов молекулярной диагностики ВЧ КРС целесообразно использовать определение нуклеотидной последовательности этой области гена для штаммовой дифференциации, так как это позволяет получить максимальные различия между изучаемыми штаммами.

В последнее время проведены работы по созданию банка клонов ДНК и определению первичной структуры концов некоторых кДНК для дальнейшей работы по определению полной структуры генома, изучению структурной организации штаммов ВЧ КРС и конст­руирования генноинженерных вакцин (экспрессия фрагментов структурных генов в E.coli). Фрагменты кДНК на Н или F гены могут быть использованы для диагностики ВЧ КРС ме­тодом гибридизации.

Устойчивость. В отношении физических факторов ВЧ КРС нестоек и легко разрушает­ся под влиянием химических веществ. Нагревание до 60°С убивает его немедленно, до 55°С - за 20 мин; в условиях комнатной температуры вируссодержащая цитратная кровь сохраня­ет активность 4-6 дн, при 5°С - 1 нед, при 0°С - более 5 лет.

Время инактивации терморезистентного вируса, за которое инактивируется 50% его при 45°С, составило 4 дн вместо 1,8 дн для исходного родительского вируса. Полученный тер­морезистентный клон (1613-1009) характеризовался безвредностью для КРС и высокой иммуногенностью, что позволило использовать его для производства сухой лиофилизированной, устойчивой к хранению вакцины.

В мясе больных животных вирус сохраняется в зависимости от скорости аутолиза и ко­личества молочной кислоты. Если рН изменяется в кислую сторону - вирус погибает за 4-6 ч. Поваренная соль консервирует его. В соленом мясе (10%-ный р-р NaCI) он сохраняется более месяца. В шкурах жвачных животных, высушенных в темном месте, вирус утрачивает патогенность через 48 ч, а в шкурах необескровленных животных - за 24 ч. При гниении ма­териала вирус быстро погибает, поэтому в тропических странах трупы уже через несколько часов после гибели животного обезвреживаются. В моче и кале вирус сохраняется не более 30 ч. 2%-ный р-р карболовой кислоты, 1%-ное известковое молоко, 2%-ная щелочь, 2%-ные р-ры крезола и лизола обезвреживают зараженные вирусом материалы. Глицерин инактивирует вирус при комнатной температуре до 10 дн. Вирус чувствителен к эфиру и хлоро­форму. УФ-лучи и солнечный свет инактивируют его в течение от 40 мин до 5 ч. В солевых экстрактах из инфицированных органов вирус сохраняется больше 1 мес.

Антигенная структура. Антигенная структура изучена недостаточно. Идентифициро­вано 5 вирусспецифических полипептидов: Н (в РГА) размером 74 кД; белок нуклеокапсида размером 62 кД; (фосфопротеид) размером 70 кД; белок слияния Fo размером 46 кД и по­липептид М (матриксный белок) размером 38 кД. Изучена гомология в нуклеотидной по­следовательности белка слияния у 3-х вирусов (чумы КРС, чумы собак и кори). Проведено клонирование и анализ последовательности гена фосфопротеина ВЧ КРС. Получены монАТ к структурным белкам (нуклеотидному белку и гликопротеинам Н и Fo) вакцинного шт. К_17-79 ВЧ КРС. Показано, что из 24 видов монАТ 10 распознавали нуклеопротеин (NP), 8 - фосфопротеин, 4 - ГА (Н) и 2 - белок слияния (Fo). МонАТ против Н нейтрализова­ли инфекционную активность вируса, тогда как подобные AT против Fo белка проявляли нейтрализующую активность только в присутствии комплемента морской свинкию. Так же с помощью монАТ к нуклеокапсидному белку Np, ГА (Н) и белку Fo изучена персистенция вируса и синтез белка М в клетках Vero.

Антигенная вариабельность и родство. АГ вариантов вируса нет. Иммунологическая идентичность полевых штаммов подтверждена многочисленными опытами перекрестного заражения. Между ВЧ КРС, ВК и ВЧС существует антигенное и иммунологическое родство. Кроме того, к ВЧ КРС оказались близки в антигенном отношении морбилливирусы, выде­ленные от дельфинов и морских свиней в Европе. Штаммовая дифференциация ВЧ КРС может производиться при сравнении нуклеотидной последовательности транслируемой последовательности F-гена исследуемых штаммов в ПЦР.

Локализация вируса. Вирус разносится кровью по всему организму и исчезает из нее с поражением ЖКТ (обычно с 4-го по 10-й день). Вирусемия совпадает с периодом гипертер­мии. Иногда вирус обнаруживают в крови на протяжении всей болезни и даже за 12 ч до начала лихорадки. Его можно обнаружить в выделениях из носовой полости с 6-го по 14-й день, в органах животных, убитых на 6-й день. За день до развития лихорадки и через не­сколько часов после смерти животного большое количество вируса содержится в слезном секрете. Концентрация вируса в крови не превышает 10²-10⁴ ТЦД₅₀/мл.

Вирус чумы крупного рогатого скота - пантропный вирус. В органах и тканях накапливается неодинаково, в более высоких титрах находится в лимфоузлах (10^6,5 ИД₅₀/мл), в слизистой оболочке сычуга (10^5,5), в легких (10⁴) и почках (10³-10⁴ ИД₅₀/мл). В небольших количествах он присутствует в мозговой ткани, поперечнополосатой мышечной ткани и спинномозговой жидкости. Вирусоносительство у животных-реконвалесцентов практически не доказано.

Антигенная активность. У животных-реконвалесцентов обнаруживаются ВНА, КСА, анти-ГА и ПА. Поэтому наиболее надежными методами оценки поствакцинального имму­нитета являются РН и РСК. Телята приобретают иммунитет через молозиво от коров-реконвалесцентов или активно иммунизированных. Он сохраняется 6-8 мес. Поскольку ма­теринские колостральные AT тормозят образование иммунитета, телят нельзя вакциниро­вать ранее этого срока, У ягнят пассивный иммунитет сохраняется не менее 4-х мес. Изучались различные участки гемагглютинина и их роль в проявлении иммунобиологиче­ских свойств его и вируса в целом.

Экспериментальная инфекция. У КРС она удается, как правило, введением вируссодержащей крови, взятой в кульминационный период болезни per os, подкожно или внутри­мышечно. Заразить можно также слюной, истечением из влагалища больного животного. Овцы и козы заражаются, однако болезнь у них проявляется общей лихорадкой и вирусоносительством до 45 дн. К искусственному заражению восприимчивы также верблюды и оле­ни. Относительно восприимчивости свиней мнения расходятся. У зараженных кроликов временно повышается температура тела. Грызуны, непарнокопытные, плотоядные, птицы и человек невосприимчивы. В конечной стадии летальной инфекции происходит интенсивное истощение лимфоцитов в лимфоузлах, селезенке и миндалинах. В трахее обнаружен некроз эпителиальных клеток с периферическим распределением АГ в эпителии бронхов.

Культивирование. Вирус культивируется в организме восприимчивых животных и в культурах клеток почки телят без предварительной адаптации. Вирус чумы КРС хорошо размножается в первичных культурах клеток почки теленка, ягненка, эмбриона коровы, макрофагах и перевиваемых клетках. ЦПД вируса развивается медленно и длится при ис­пользовании больших концентраций вируса в течение 5-8 сут. Вслед за появлением цитоплазматических включений в инфицированных клетках, в том числе и симпластах, образу­ются внутриядерные оксифильные включения в количестве 2-4. Хроматиновая сеть ядра на­рушается лишь вокруг включений. В некоторых случаях они занимают почти все ядро.

Развитие вируса в культуре начинается через 3-6 ч после заражения. В этот период ви­рус ни в клетках, ни в среде не обнаруживается. Культура клеток СПЭВ чувствительна к вирусу чумы мелких жвачных животных и может быть использована для изготовления диаг­ностических АГ.

Специфичность цитопатических изменений подтверждаются РН. Цитопатические изме­нения развиваются одновременно с накоплением вируса в инфицированных культурах кле­ток. Новую популяцию вируса обнаруживают через 6-8 ч после заражения в титре 10³-10⁴ ТЦД₅₀/мл. Позднее титр вируса нарастает и к 5-7 сут достигает максимальной величины (10^5,5-10^6,5 ТЦД₅₀/мл). Одновременно происходит и накопление КС-антигена. Титр его на 5-7-е сут равен 1:16 - 1:64 (24, 27, 34). В клеточной линии почек африканских зеленых мар­тышек вирус образует бляшки. Однако лапинизированный (LIII) и капринизированный штаммы вируса, размножаясь в культуре клеток, не вызывают в первых пассажах ЦПД.

Помимо первичных культур клеток, культивирование вируса удавалось и на перевивае­мых линиях клеток. Отработаны основные параметры поддержания клеток и ВЧ КРС шт.ЛТ, определен возраст культуры, плотность клеток в монослое, состав питательной сре­ды, периодичность её смены, доза заражения клеточных культур МДВК, ПТП, ПС, СПЭВ, время сбора вируса. Линия клеток СПЭВ оказалась более чувствительной к вирусу чу­мы мелких жвачных. ЦПД выявлялось с 1-го пассажа, процент пораженных клеток состав­лял 70-90. ЦПД проявлялось на 3-11 сут в зависимости от количества проведенных пасса­жей. Титр вируса на культуре Vero составлял 10⁴ТЦД₅₀/мл. Культура СПЭВ, как наиболее чувствительная к ВЧ МЖЖ, может быть использована для изготовления диагностических АГ. Вирус способен индуцировать образование интерферона в культуре клеток, причем более старые культуры образовывали больше интерферона, чем молодые.

ГА свойства. ГА ВЧ КРС получают экстрагированием вируссодержащей культуры кле­ток эмбриона КРС. Экстракт концентрируют в 20 раз диализом. Концентрированный вирус с титром не ниже 10⁶ТЦД ₅₀/мл агглютинирует эритроциты обезьян и в меньшей степени эритроциты кроликов, морских свинок, мышей и крыс. ГА ВЧ КРС и ВК антигенно различ­ны, а иммунологическое родство обусловлено присутствием общего АГ в их нуклеокапсидах. Гемагглютинирующий АГ у ВЧ КРС выявляют только после специальной обработки. Антисыворотка к ВЧ КРС нейтрализует ГА активность вируса кори.