Лабораторная работа 3.2

Изучение спектральных свойств оксигемоглобина

Материалы и оборудование: спектрофотометр СФ-46, центрифуга MPW-340, весы для уравновешивания центрифужных пробирок, кровь человека или животного (с антикоагулянтом), 0,85 % NaCl, фосфатный буфер (0,01 моль/л, рН 7,4), пробирки, пипетки, фильтровальная бумага.

Цель работы: построить спектр поглощения раствора оксигемоглобина, охарактеризовать его спектральные свойства.

Ход работы:

1. Выделить оксигемоглобин из эритроцитов крови.

Кровь с антикоагулянтом (гепарин) смешивают с изотоническим раствором хлорида натрия (0,85 %) в соотношении ≈ 1:1. Эту смесь центрифугируют в течение 10 мин со скоростью 6000 об/мин на центрифуге МРW-340. Надосадочную жидкость, содержащую плазму и тонкий слой лейкоцитов, удаляют пипеткой Пастера. Осадок смешивают с 0,85 % NaCl и вновь центрифугируют 10 мин при 6000 об/мин. Эту операцию повторяют дважды. К полученному осадку эритроцитов добавляют дистиллированную воду. Мембраны эритроцитов осаждают центрифугированием в течение 20 мин при 8000 об/мин. Надосадочная жидкость содержит в основном раствор оксигемоглобина, который разбавляют дистиллированной водой до требуемой концентрации, при этом оптическая плотность в полосе Соре должна быть равна ≈ 0,8 – 0,9 ед., т.к. при D > 1 резко возрастает погрешность измерения, а при меньших значениях D₄₁₄ будет сложно зарегистрировать другие полосы поглощения гембелка.

Концентрацию оксигемоглобина [НbО₂] в моль/л определяют спектрофотометрическим способом, применяя для расчета формулу:

[НвО₂] = (1,64D₅₇₆ + 0,64D₅₆₀ + 0,72D₅₄₀)/10^-4, (3.11)

где D₅₇₆, D₅₆₀ и D_{540 _}- величины оптической плотности раствора оксигемоглобина соответственно при 576, 560 и 540 нм.

В работе используют растворы оксигемоглобина с концентрациями 5·10^-4 – 5·10^-5 моль/л.

2. Измерить оптическую плотность раствора оксигемоглобина в диапазоне длин волн от 220 до 750 нм. Измерения производят через 5 нм, в области максимумов – через 1 - 2 нм.

3. Построить спектр поглощения раствора нативного оксигемоглобина.

4. Сделать выводы: охарактеризовать спектральные свойства оксигемоглобина; используя литературные данные, объяснить, какими электронными переходами обусловлены данные максимумы.

Лабораторная работа 3.3

Влияние температуры и УФ-света на спектральные

свойства оксигемоглобина

Материалы и оборудование: спектрофотометр СФ-46, центрифуга MPW-340, весы для уравновешивания центрифужных пробирок, кровь человека или животного (с антикоагулянтом), 0,85 % NaCl, фосфатный буфер (0,01 моль/л, рН 7,4), термостат, установка для УФ-облучения, пробирки, пипетки, фильтровальная бумага.

Цель работы: исследовать спектральные свойства термо- и фотомодифицированных растворов оксигемоглобина человека.

Ход работы:

1. Приготовить буферный раствор оксигемоглобина человека (3 - 5·10^-4 моль/л) (см. работу № 1 «Изучение спектральных свойств оксигемоглобина»).

2. А. Полученный раствор инкубировать при температуре 45 ^оС в течение 20 мин.

Б. Полученный раствор (3 мл) облучить УФ-светом через светофильтр УФС-1 (240 – 390 нм) в дозе 1500 Дж/м².

3. Измерить оптическую плотность модифицированного (по варианту А или Б) раствора оксигемоглобина в диапазоне длин волн от 220 до 750 нм. Измерения производят через 5 нм, в области максимумов – через 1 -2 нм.

4. Построить спектр поглощения раствора модифицированного оксигемоглобина, сравнить полученные данные со спектром поглощения нативного гембелка, взятого в той же концентрации (контрольный раствор).

5. Сделать выводы о влиянии данных физических факторов (температуры и УФ-света) на структурные свойства гембелка.

Лабораторная работа 3.4

Исследование вклада активных форм кислорода

в процесс фотомодификации оксигемоглобина

Материалы и оборудование: спектрофотометр СФ-46, центрифуга MPW-340, весы для уравновешивания центрифужных пробирок, кровь человека или животного (с антикоагулянтом), 0,85 % NaCl, фосфатный буфер (0,01 моль/л, рН 7,4), D-маннит, установка для УФ-облучения, пробирки, пипетки, фильтровальная бумага.

Цель работы: исследовать вклад ОН^·-радикалов в фотоиндуцированные изменения структуры оксигемоглобина.

Ход работы:

1. Приготовить буферный раствор оксигемоглобина человека (3 - 5·10^-4 моль/л) (см. работу № 1 «Изучение спектральных свойств оксигемоглобина»).

2. Приготовить раствор D-маннита (5,4·10^-4 моль/л). D-маннит, как и другие спирты (третичный бутанол, этанол и др.) является активным перехватчиком ОН^·-радикалов, образующихся при действии УФ-света.

3. Смешать полученные растворы в объемном соотношении 1:1. Контрольный раствор оксигемоглобина развести дистиллированной водой в той же пропорции.

4. Полученные растворы (3 мл) облучить УФ-светом через светофильтр УФС-1 (240 – 390 нм) в дозе 1500 Дж/м² .

5. Измерить оптическую плотность полученных растворов оксигемоглобина в диапазоне длин волн от 220 до 750 нм. Измерения производят через 5 нм, в области максимумов – через 1 -2 нм.

6. Построить спектры поглощения растворов УФ-модифицированного и нативного оксигемоглобина.

7. Сравнив полученные спектры поглощения, сделать вывод о вкладе гидроксильных радикалов в фотоиндуцированные изменения структуры оксигемоглобина.

Лабораторная работа 3.5

Исследование спектральных характеристик растворов оксигемоглобина в присутствии активных форм кислорода

Материалы и оборудование: спектрофотометр СФ-46, центрифуга MPW-340, весы для уравновешивания центрифужных пробирок, кровь человека или животного (с антикоагулянтом), 0,85 % NaCl, фосфатный буфер (0,01 моль/л, рН 7,4), пероксид водорода, сульфат железа (II), пробирки, пипетки, фильтровальная бумага.

Цель работы: исследовать влияние Н₂О₂ и ОН^·-радикалов на спектральные свойства растворов оксигемоглобина.

Ход работы:

1. Приготовить буферный раствор оксигемоглобина человека (3 - 5·10^-4 моль/л) (см. работу № 1 «Изучение спектральных свойств оксигемоглобина»).

2. Приготовить реактив Фентона (2·10^-4 моль/л Н₂О₂ и 1·10^-5 моль/л FeSО₄). Реактив Фентона является источником ОН^·-радикалов, образующихся в реакции:

Fe²⁺ + H₂O₂ → Fe³⁺ + OH^- + OH^·.

Гидроксильный радикал является сильнейшим окислителем, он вызывает повреждения молекул белков и нуклеиновых кислот, индуцирует пероксидное окисление липидов, приводит к разрыву СН-связей. Это является причиной сильного мутагенного, канцерогенного и цитотоксического действия данного радикала.

3. А. Смешать раствор оксигемоглобина и реактив Фентона в объемном соотношении 1:1.

Б. Смешать раствор оксигемоглобина и Н₂О₂ (2·10^-4 моль/л) в объемном соотношении 1:1.

Контрольный раствор оксигемоглобина развести дистиллированной водой в той же пропорции.

4. Измерить оптическую плотность полученных растворов оксигемоглобина в диапазоне длин волн от 220 до 750 нм. Измерения производят через 5 нм, в области максимумов – через 1 -2 нм.

5. Построить спектры поглощения растворов модифицированного и нативного оксигемоглобина.

6. Сравнив полученные спектры поглощения, сделать вывод о вкладе гидроксильных радикалов и Н₂О₂ в изменения спектральных свойств (и структуры) оксигемоглобина.