3.6. Спектральные приборы

Перед тем, как приступить к практической работе, необходимо изучить принцип действия современных фотоэлектроколориметров и спектрофотометров, структурную и оптическую схемы спектрофотометра СФ-46. Подробно принципы работы и основные виды спектральных приборов изложены в учебном пособии: Артюхов В.Г., Путинцева О.В. Оптические методы анализа интактных и модифицированных биологических систем / Изд-во ВГУ, 1996.

ПОРЯДОК РАБОТЫ на СФ-46

1. Включение спектрофотометра

1.1. Закрыть фотоэлемент, установив рукоятку переключения шторки в положение ЗАКР, установить ширину щели 0,15 нм.

1.2. Установить рычаг переключения ламп в нужное положение: «Д» - дейтериевая лампа (190 – 350 нм), «Н» - лампа накаливания (340 – 1100 нм). Внимание! В области спектра от 190 до 210 нм частичное поглощение световой энергии кислородом воздуха уменьшает отношение полезного сигнала к рассеянному излучению, что приводит к увеличению погрешности измерения. Для устранения этого явления при работе в данной области спектра в СФ-46 предусмотрена возможность продувки монохроматора сухим азотом. Газ может подаваться через штуцер, расположенный на задней стенке монохроматора.

1.3. Нажать кнопку СЕТЬ, после чего должна загореться индикаторная лампа СЕТЬ, и нажать клавишу ПУСК на клавиатуре микропроцессорной системы (МПС), после чего должна высветиться запятая на табло МПС.

1.4. При установке рычага переключения ламп в положение «Н» лампа накаливания загорается сразу после нажатия кнопки СЕТЬ, при установке рычага в положение «Д» дейтериевая лампа загорается автоматически после минутного прогрева. Стабильная работа дейтериевой лампы обеспечивается через 30 мин после ее включения. лампы накаливания – через 10 – 15 мин.

1.5. Стабильная работа спектрофотометра обеспечивается через 30 мин после его включения.

1.6. Выключение спектрофотометра производить нажатием кнопки СЕТЬ.

2. Подготовка к измерению

2.1. Включить спектрофотометр, как указано в подразделе 1.

2.2. Установить в держатель кюветного отделения от одного до трех исследуемых образцов, в четвертую позицию держателя должен быть установлен контрольный образец. Кюветы с образцами должны быть установлены ровно.

Правильно установить держатель на каретку в кюветном отделении.

2.3. Установить требуемую длину волны, вращая рукоятку длин волн в сторону увеличения длин волн. Если при этом шкала повернется на большую величину, то возвратить ее назад на 5—10 нм и снова подвести к требуемому делению.

2.4. Установить в рабочее положение фотоэлемент, соответствующий выбранному спектральному диапазону измерения. Сурьмяно-цезиевый фотоэлемент (Ф) с окном из кварцевого стекла применяется для измерений в области спектра от 190 до 700 нм, кислородно-цезиевый фотоэлемент (К) - для измерений в области спектра от 600 до 1100 нм. Длина волны, при которой следует переходить от измерений с одним фотоэлементом к измерениям с другим фотоэлементом, указана в паспорте СФ-46.

2.5. Перед каждым новым измерением, когда неизвестна величина выходного напряжения, следует устанавливать ширину щели 0,15 нм во избежание засвечивания фотоэлементов.

2.6. Снимать показания следует при плотно закрытой крышке кюветного отделения.

Внимание! Нельзя открывать крышку кюветного отделения при открытой шторке! Это приведет к засвечиванию фотоэлемента. Открывать крышку кюветного отделения следует только при установленной в положение ЗАКР рукоятке переключения шторки.

3. Проведение измерений

3.1. Установить рукоятку переключателя шторки в положение ЗАКР.

3.2. Нажать клавишу «Ш(0)» на МПС, при этом на фотометрическом табло (или на вольтметре) высветится значение сигнала в вольтах, пропорциональное значению темнового тока фотоэлемента.

3.3. Установить рукояткой НУЛЬ на фотометрическом табло числовое значение в диапазоне от 0,05 до 0,1 (темновой ток). (Показание с табло следует снимать, нажимая клавишу «Ш(0)» до появления показания, равного предыдущему или отличающегося от предыдущего не более чем на 0,001. Последнее показание заносится в память МПС и остается там до следующего нажатия клавиши «Ш(0)»).

3.4. Перемещая каретку рукояткой, установить на пути потока излучения контрольный образец. При отсутствии контрольного образца измерение будет производиться относительно воздуха.

3.5. Установить рукоятку переключателя шторки в положение ОТКР.

3.6. Нажимая клавишу «К», рукояткой ЩЕЛЬ установить на фотометрическом табло показание в диапазоне от 0,5 до 5,0 (световой ток - I_o).

Наблюдая за миганием запятой на фотометрическом табло (частота мигания — один раз в секунду), отсчитать 10 с и нажать клавишу «К( 1)».

Примечание. При нажатии клавиши «К(1)» слева высвечивается индекс «1».

При показании, большем 5,0, на табло высвечивается индекс «П».

3.7. Установить поочередно на пути потока излучения измеряемые образцы, перемещая каретку рукояткой, снять показания (I) с фотометрического табло.

3.8. При непродолжительных измерениях, во время которых величина темнового тока не изменяется, можно не вводить эту величину в память МПС при каждом измерении. В этом случае все последующие измерения, начиная со второго, следует производить, начиная с операции, указанной в п.3.4.

3.9. Рассчитать величину оптической плотности исследуемого объекта по формуле D = lgI_o/I.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Лабораторная работа 3.1

Исследование спектральных характеристик

сывороточного альбумина

Материалы и оборудование: спектрофотометр СФ-46, кристаллический препарат сывороточного альбумина, фосфатный буфер (0,01 моль/л, рН 7,4), пробирки, пипетки, фильтровальная бумага.

Цель работы: построить спектр поглощения раствора сывороточного альбумина, охарактеризовать спектральные свойства данного белка.

Ход работы:

1. Приготовить буферный раствор белка в концентрации 5·10^-5 моль/л. Молекулярная масса сывороточного альбумина равна 68 500 Да.

2. Измерить оптическую плотность раствора сывороточного альбумина в диапазоне длин волн от 220 до 310 нм. Измерения производят через 5 нм, в области максимумов – через 1 -2 нм.

3. Построить спектр поглощения раствора альбумина.

4. Сделать выводы: охарактеризовать спектральные свойства однокомпонентного белка; используя литературные данные, объяснить, какими электронными переходами обусловлены максимумы поглощения альбумина.