3.3. Качественные и количественные показатели

поглощения света. Закон Бугера – Ламберта – Бера

Поглощение света внешне проявляется в ослаблении светового потока после прохождения через исследуемый объект. С помощью приемника излучения (фотоэлемент, фотоумножитель) можно определить, во сколько раз интенсивность света, падающего на образец (I_o), больше интенсивности света, выходящего из образца (I).

Для описания способности целого объекта поглощать свет используют следующие характеристики:

1. оптическая плотность (D) – десятичный логарифм отношения интенсивности света, падающего на образец, к интенсивности света, выходящего из образца:

D = lgI_o/I; (3.1)

как и любая логарифмическая величина, оптическая плотность не имеет размерности, измеряется в единицах оптической плотности;

2. коэффициент светопропускания (Т), или просто светопропускание – отношение интенсивности света, вышедшего из образца, к интенсивности света, падающего на образец:

T = I/I_o, (3.2)

измеряется в долях или процентах (T = I/I_o·100 %);

3. доля поглощенного светового потока (α), или просто светопоглощение:

α = (I_o – I)/I_o = 1 – T, (3.3)

так же, как и Т, светопоглощение измеряется в долях или процентах.

4. молярные (ε и έ) и молекулярный (s) коэффициенты поглощения.

έ – натуральный молярный коэффициент поглощения (экстинкции), его физический смысл – суммарное поперечное сечение поглощения всех молекул одного моля вещества;

ε – молярный коэффициент поглощения.

Молярный коэффициент экстинкции характеризует способность молекул вещества поглощать свет определенной длины волны и определяется структурными особенностями молекул данного вещества; он соответствует величине оптической плотности раствора с концентрацией 1 моль/л при длине оптического пути 1 см.

Размерность ε и έ – л/(моль∙см).

Параметр s является поперечным сечением поглощения молекулы, другое его название – молекулярный показатель поглощения, размерность – см²/молекула. Физический смысл s – эффективное сечение молекулы, при попадании в которое происходит поглощение кванта света данной длины волны.

Пусть монохроматический пучок света с интенсивностью I_o (квант/м²·с) падает на объект правильной формы перпендикулярно его поверхности (рис. 3.1). Найдем параметры, которые характеризуют способность объекта поглощать свет.

Допустим, что все молекулы поглощающего свет вещества распределены равномерно по объекту; концентрацию, выраженную в числе молекул в 1 см³, обозначим через n.

При использовании пучка света с низкой интенсивностью I_o концентрация возбужденных молекул намного меньше n.

Выделим в объекте на расстоянии x от освещаемой поверхности элементарный объем толщиной dx (рис. 3.1). На этот объем падает свет с интенсивностью i, которая меньше I_о в результате поглощения света в предыдущей части объекта. При прохождении через данный объем интенсивность уменьшается на величину di. Эта величина будет пропорциональна i, n и dx:

-di = s·n·i∙dx, (3.4)

где s - коэффициент пропорциональности (поперечное сечение поглощения молекулы). Интегрирование этого уравнения при изменении x от 0 до l (длина оптического пути, толщина образца, см) дает:

I = I_o exp(-s·n·l) (или I = I_o e ^-s·n·l). (3.5)

Это выражение называется формулой Бугера – Ламберта – Бера.

Как правило, закон Бугера – Ламберта – Бера используют в иной форме:

I = I_o e ^-έ·с·l (3.6)

или I = I_o 10 ^-ε·с·l, (3.7)

где с – молярная концентрация вещества.

Нетрудно рассчитать, что ε = 0,43έ (т.к. е ≈ 2,71 ≈ 10^0,43). Поперечное сечение поглощения молекулы связано с молярным коэффициентом экстинкции соотношением: s = 3,8·10^-21ε.

Значения коэффициентов поглощения не зависят от условий измерения (с, I и др.); для многих веществ они определены и внесены в соответствующие справочные издания.

Важнейшим следствием из закона Бугера-Ламберта-Бера является следующее положение: оптическая плотность прямо пропорциональна концентрации данного вещества (рис.3.2, кривая 1). В самом деле, из формулы (1.8) следует, что

I/ I_o = 10^-ε·с·l,

прологарифмировав это выражение, получаем lg I/I_o = - ε·с·l,

т.к. по определению D = lgI_o/I, следовательно,

D = сl. (3.8)

Закон Бугера-Ламберта-Бера выведен для достаточно разбавленных растворов при использовании монохроматического света. Значительные отклонения от закона могут быть обусловлены:

1) свойствами анализируемого образца - способностью молекул вещества при больших концентрациях образовывать агрегаты, что приводит к росту светорассеяния и кажущемуся повышению его оптической плотности (рис.3.2, кривая 2). Поэтому фотометрируемый раствор должен оставаться истинно молекулярным во всем интервале исследуемых концентраций. Если это условие не соблюдается, необходимо перейти в область более низких концентраций или применять защитные коллоиды, препятствующие образованию твердой фазы, или же изменить схему всего процесса измерения спектральных свойств образца;

2) конструкцией прибора: при использовании немонохроматического пучка света (например, при работе на фотоэлектроколориметрах) (рис.3.2, кривая 3), а также при работе в области, где погрешность прибора максимальна (см. раздел 3.4).

В молекулярной спектрофотометрии взаимодействие светового излучения со сложными многоэлектронными системами, каковыми являются биомолекулы, описывают с помощью молекулярных спектров поглощения.

Спектр поглощения – это зависимость оптической плотности или коэффициента экстинкции (ε, έ или s) вещества от длины волны света, падающего на объект. Спектр поглощения представляют в виде графика: по оси ординат откладывают величины D или ε, а по оси абсцисс – длину волны света (λ).

Поглощение света в видимой и УФ-области спектра обусловливает изменения в электронном состоянии молекулы (см. табл. 3.1), поэтому спектры поглощения в этих диапазонах длин волн получили название электронных.

Спектр поглощения является индивидуальной характеристикой вещества, поэтому структурные особенности его молекул находят отражение в спектрах поглощения. На основании изучения и интерпретации спектров поглощения можно проводить качественный и количест­венный анализ веществ.

Свет поглощается не всей молекулой равномерно, а отдельными ее группами. Хромофоры – атомы или группы атомов, поглощающих кванты света.

Поглощение атомами энергии фотона характеризуется отдельными линиями в спектре, отражающими только электронные переходы. При поглощении кванта света молекулой электрон переходит с основного уровня (связывающая орбиталь) на колебательные подуровни возбужденного состояния (разрыхляющая орбиталь); так как возможен переход электрона на различные колебательные подуровни данного уровня, то спектр поглощения молекулы описывается не линией, как в атомах, а полосой («слепком» линий).

При одноэлектронном переходе зависимость D (или ε) от λ обычно описывается кривой распределения Гаусса (см. раздел 4.7, рис. 4.6). Полоса поглощения в электронном спектре характеризуется тремя основными параметрами:

- максимальным значением оптической плотности (D_max) или молярного коэффициента экстинкции (ε_max) (максимум поглощения);

- длиной волны максимального поглощения (λ_max, нм), соответствующей D_max;

- эффективной шириной полосы поглощения ∆λ_½, нм (или полушириной полосы поглощения), она соответствует расстоянию между двумя точками полосы поглощения, находящимися на высоте ½D_max данной полосы.

Спектр пропускания – это график зависимости светопропускания (Т) от длины волны света, падающего на образец.

В спектрах поглощения сложных биомолекул или их смеси разные полосы поглощения (то есть полосы, обусловленные разными электронными переходами) могут иногда перекрываться. Для расшифровки таких спектров целесообразно применять производную спектрофотометрию (см. раздел 3.7).

Изменение структурного состояния биомакромолекул вызывает соответствующие изменения спектральных свойств поглощающих систем. Эти изменения в электронных спектрах поглощения характеризуются либо увеличением поглощения (гиперхромный эффект), либо его уменьшением (гипсохромный эффект), смещением максимума поглощения в длинноволновую (батохромный сдвиг) или коротковолновую (гипсохромный сдвиг) области спектра. Но во всех случаях избирательное поглощение света в определенной области спектра обусловлено наличием определенных хромофорных групп. Иногда в молекуле рядом с хромофором находятся другие активные группы атомов (ауксохромы), которые могут вызывать гиперхромный эффект в спектре поглощения и обусловливать батохромный сдвиг максимума поглощения. Ауксохромы –это группы атомов, которые сами не поглощают фотоны, но при включении в молекулу приводят к смещению максимума полосы поглощения и к изменению ее интенсивности. Например, в белках ауксохромами являются амино- и сульфгидрильные группы.

При определении концентрации аналитической формы оптическую плотность измеряют при оптимальной длине волны, если работают на спектрофотометре, или в оптимальном интервале длин волн при работе на фотоэлектроколориметре с применением светофильтра. При выборе оптимальной длины волны ориентируются на наибольшее различие в поглощении аналитической формы и исходных реагентов (если определяют концентрацию продукта биохимической реакции), при этом необходимо учитывать в их спектрах число максимумов поглощения, высоту (D_max) полос поглощения, форму контура полосы поглощения, чувствительность фотометрического прибора в данной спектральной области. Разность между максимумами полос поглощения аналитической формы и исходного реагента в фотометрическом анализе называют контрастностью цветной реакции. Чем больше контрастность, тем удобнее данная реакция для фотометрии.

Поглощение раствора анализируемого вещества всегда измеряют относительно раствора сравнения, поглощение которого принимают за оптический нуль. Раствор сравнения содержит все исходные вещества, за исключением определяемого.