9.4 Ізоелекгричний стан білка. Ізоелєктрична точка та методи її визначення. Йонний стан біополімерів в водних розчинах.

Молекула белка имеет электрический заряд, обу­словленный почти исключительно диссоциацией ионогенных групп — СООН и— NН₂. Эти группы принадле­жат концевым аминокислотам, т. е. находящимся на концах полипептидных цепочек, а также дикарбо-новым и диаминовым аминокислотам, расположенным в середине цепочки.

Схематически диссоциацию этих групп белка, учи­тывая гидратацию аминогрупп, можно представить следующим образом:

СООН СООН СОО^- + Н⁺

R → R → R

NH₂ + HOH NH₃OH NH₃⁺ + OH^-

Существует мнение, что образование диполярного белкового иона, т. е. иона,-одновременно обладаю­щего положительными и отрицательными зарядами (амфиона), совершается за счет перехода протона из карбоксильной группы в аминогруппу:

Заряд всей белковой молекулы в нейтральной сре­де определяется соотношением количества свободных групп СООН и NН₂ и степенью их диссоциации. Оче­видно, чем больше .слабокислых групп СООН, тем выше окажется отрицательный заряд, и белок будет проявлять свойства слабой кислоты. Преобладание слабощелочных групп NН₂ сообщает белку основные свойства и положительный заряд.

В кислой среде белок заряжается положительно:

COO^- + H⁺ COOH

R → R

NH₃⁺ NH₃⁺

В щелочной среде белок заряжается отрицательно:

COO^- COO^-

R → R

NH₃⁺ + OH^- NH₃OH

Таким образом, заряд белка зависит от реакции сре­ды, а также от соотношения количества его карбо­ксильных и аминных группировок.

Значение рН, при котором белок находится в изоэлектрическом состоянии (тоесть , когда суммарный заряд макромолекулы равен нулю), называется его изоэлектрической точкой.

Большинство природных белков, содержит значи­тельные количества — 25 — 30% дикарбоновых амино­кислот (глютаминовой и аспарагиновой) и, следовательно, относятся к «кислым» белкам. Существует и относительно небольшая группа «основных» белков с преобладанием свободных групп NН₂ за счет повышенного (до 80%) содержания диаминовых аминокис­лот (лизина, аргинина, орнитина, цитруллина). Изоэлектрическая точка «кислых» белков лежит в слабо­кислой среде, «основных» — в слабощелочной среде. В таблице 1 приводятся изоэлектрические точки неко­торых белков.

Таблица 1.

Для высаливания или желатинирования белков це­лесообразно приводить их в изоэлектрическое состоя­ние. Этого можно достигнуть, поместив белки в бу­ферный раствор с рН, равным их изоэлектрической точке .

В других случаях, например при электрофоретическом разделении белков, нужно, чтобы они, наобо­рот, имели достаточный заряд. Для этого белковую смесь помещают в буферные растворы с рН, заведо­мо далеко отстоящим от их изоэлектрической точки.

Методы определения изоэлектрической точки. Изоэлектрическая точка является существенной ха­рактеристикой белков. Имеется ряд методов ее опре­деления.

Метод электрофореза: исследуемый белок по­двергают электрофорезу в буферных растворах с раз­ным значением рН. Очевидно, что в буфере с рН, равным изоэлектрической точке белка, последний электронейтрален и двигаться в электрическом поле не будет.

Используя схему Кройта: в пробирки нали­вают буферные растворы с различным значением рН, затем туда вносят равные количества исследуемого белка и добавляют спирт. Наиболее выраженная коа­гуляция (помутнение) произойдет в пробирке с буфе­ром, рН которого соответствует изоэлектрической точке белка.

По желатинированию: в пробирки наливают буферные смеси с различным значением рН и добав­ляют достаточно концентрированный раствор иссле­дуемого белка. Желатинирование его произойдет быстрее всего в пробирке, рН которой наиболее близ­ко к изоэлектрической точке белка.

По набуханию: одинаковые количества сухого белка насыпают в ряд пробирок, туда же приливают равные объемы буферных, растворов с различным значением рН. Наименьшее набухание белка окажет­ся в пробирке, где рН среды будет ближе всего к изоэлектрической точке белка .