1.2.3. Единицы активности ферментов. Методы определения активности ферментов.
Каждый ферментный препарат должен быть охарактеризован по его ферментативной активности. Что такое активность фермента в самом простом понимании?
Это единица количества субстрата, превращенное ферментом, в единицу времени, отнесенное к количеству самого фермента.
Международным биохимическим союзом выработана специальная понятия – стандартная единица фермента (Е) единица на русском или (unit) – на английском.
Стандартная единица фермента – это такое количество фермента, которое катализирует превращение одного микромоля данного субстрата за одну минуту при заданных условиях. Для определения числа стандартных единиц фермента желательно пользоваться t =250, рН оптимум, и Ссубстрат – оптимум.
Для определения числа стандартных единиц нужно знать скорость ферментативной реакции. Из курса биохимии вы вероятно знаете что ход ферментативной реакции можно представить в виде графика имеющего вид (Рис.1.12):
Кривая сначала круто поднимается вверх, затем ее подъем замедляется и наконец может замедляется и наконец становится параллельной оси абсцисс. Замедление реакции может вызываться следующими причинами:
1. Так как в принципе каждая ферментативная реакция обратима, то в силу закона действующих масс скорость реакции равное произведению концентрации реагирующих веществ (и образующиеся продукты реакции будут влиять на скорость прямой реакции)
2. В процессе реакции концентрация исходного материала может оказаться ниже насыщающей концентрации и естественно скорость также будет замедляться.
3. Сам фермент во время реакции частично разрушаются и естественно уменьшается скорость реакции
4. Торможение продуктами реакции, даже если реакция необратима.
В связи с выше изложенным, для точного определения скорости ферментативной реакции, измерение нужно проводить в начале реакции, когда количество превращенного субстрата не выше 20% от исходного. В этом случае практически можно избежать действие четырех вышеназванных артефакторов.
Важнейшим условиями правильного определения истиной начальной скорости реакции являются:
- применение таких физических методов, которые дают возможность наблюдать за ходом реакции непрерывно (СФ, электропроводимость и т.д.);
- применение по возможности насыщающих концентрации субстрата (SO);
Зная скорость ферментативной реакции (т.е. активность), можно рассчитать и удельную активность биокатализатора. Удельная активность – это число единиц, отнесенное к одному миллиграмму белка в ферментом препарате.
Официальной единицей активности ферментов является катал (кат) – количество фермента, которое превращает один моль субстрата в одну секунду. Это очень большая величина и активность фермента чаще выражают в микрокаталах: 1 мкат = 1•10-6 кат
В энзимологии пользуются также понятием молекулярная активность. Под молекулярной активностью понимают число молекул данного субстрата или эквивалентно затронутых групп, превращаемых за одну минуту одной молекулой фермента при оптимальной концентрации субстрата. Как следует из определения, для вычисления молекулярной активности фермента, нужно знать его молекулярную массу.
Присутствие фермента в исследуемой среде (пробе) можно установить по скорости накопления продуктов данной ферментативной реакции или по скорости исчезновения субстрата. Для этих целей применяются самые разнообразные методы – химические, поляриметрические, хроматографические, спектральные.