1.4.2 Механизмы конкурентного ингибирования ферментативных реакций.

Многие из известных конкурентных ингибиторов по своей химической природе близки обычным субстратом и поэтому их иногда называют субстратными аналогами. Считается, что такие ингибиторы имеют пространственную структуру типа ключа, который может входить в «замок» активного центра фермента, однако не открывает замок, т.е. реакции не идет (Рис.1.27). Например, конкурентное ингибировании лежит в основе механизма действия сульфамидного препарата (стрептоцида). Структура стрептоцида очень близка структуре α– аминобензойной кислоты – важного витамина многих бактерий. Стрептоцид ингибирует фермент участвующий в превращение α– аминобензойной кислоты в фолиевую кислоту, тем самым блокирует биохимический аппарат бактерий и они гибнут (Рис.1.28).

1.4.3. Механизмы неконкурентного (аллостерического) ингибирования ферментных реакций.

При другом механизме, называемой аллостерической регуляцией, поведение ФСК типично для неконкурентного ингибирования. Название аллостерический (т.е. имеющий другую форму) было дано этому механизму с начало на том основании, что по своему строению. Многие эффекторы ферментативной активности существенно отличаются от субстратов. Т.е. регуляторное действие таких эффекторов основано на их связывание со специфическим регуляторным центром фермента, отличным от активного центра. Поэтому ферменты обладающие центрами регуляции и катализа называют аллостерическими.

Аллостерическая регуляция может как ингибировать, так и активировать каталитическую способность фермента.

Рассмотрим схему отображающую процесс аллостерической регуляции (Рис .1.29).

Как видно из схемы связывания активатора А и субстрата S приводит к каталитически активной форме (R) фермента, а связывание ингибитора изменяет конформацию всех субъединиц в олигомерном белке таким образом, что молекула белка принимает неактивную Т-форму.

Следует отметить, что большинство аллостерических ферментов являются олигомерными белками, поэтому фермент на схеме изображен в виде 2-х субъединиц.

Доказательством справедливой этой аллостерической теории ферментативной реакции явилось экспериментальное изучение аспартилтранскарбамоилазы (АТС – азы). После разделения фермента на 2 субъединицы выяснилось, что на обладающую каталитической активностью крупную субединицу ингибитор интактного фермента ЦТФ не влияет. Напротив, меньшая субъединица каталитически не активна, но связывает ЦТФ. Эффекторы также могут влиять на такие параметры как сродство субстрата к ферменту, концентрацию несвязанного фермента, скорость распада ФСК, на кофакторы.

1.4.4.Кинетика ферментных реакций при конкурентном ингибировании.

Теперь попробуем с помощью уравнений М.М. количественно описать влияние эффекторов. Если ингибитор является химическим аналогом субстрата, не способным претерпевать каталитическое превращение, по занимающим активное место в молекуле катализатора (т.е. наблюдается конкурентное ингибирование) возникает альтернатива: образуется либо неактивный продукт ЕI, либо промежуточное соединение ЕS.

E + S ↔ ES (1) K_S константы

E + I ↔ EI (2) K_i диссоциации

Медленная стадия этих реакций

E + S → EР (3)

Поскольку часть фермента связана в комплексе EI, не весь фермент участвует в каталитическом превращением субстрата и скорость реакции в присутствии ингибитора замедляется.

Общее содержание фермента состоит из свободного, и входящего в комплексы ES и EI. Тогда уравнение материального баланса по ферменту выглядит следующим образом:

[Е] + [ES] + [EI] = [E]₀ (4)

Если допустить, что концентрации промежуточных продуктов ES и EI равновесны и учесть уравнению общего материального баланса по ферменту, то скорость реакции можно выразить через общую концентрацию фермента [E]₀ и концентрации свободного субстрата [S] и ингибитора [I].

(5)

Общая скорость реакции будет определяться медленной стадий, т.е. имеет вид:

V =k₊₂ [ES] (6)

Так как продукты реакции образуются только при распаде ES. Если образование комплекса [EI] является обратимым процессом, то добавление ингибитора не меняет максимальной скорости реакции: (7) Но влияет на эффективное значение константы Михаэлиса. Это следует из того, что в условиях насыщения выполняются условия:

[s₀ ]>>K_s ; [s₀ ]>>K_i ; [s₀ ]>>[I] ;

А при этих условиях весь ингибитор из комплекса EI будет вытеснен молекулами S, т.е. концентрация ЕS будет близка к [Е]₀ независимо от наличия в системе ингибитора, который остается в свободном состоянии. А эффективна константа Михаэлиса, как видно из уравнения (5) в присутствии конкурентного ингибитора возрастает:

(8)