Глава 2.

Иммобилизованные ферменты и инженерная энзимология.

2.1.Носители для иммобилизации ферментов и клеток

Современная инженерная энзимология базируется на применение биокатализаторов в иммобилизованном виде отличающихся высокой стабильностью и возможностью многократного использования. Иммобилизация биокатализаторов - это перевод их в фиксированное на или в носителе состояние, с сохранением максимально возможной каталитической активности. Для получения иммобилизованных ферментов и клеток используют большое число носителей – органических и неорганических которые должны обладать следующими свойствами: .высокая химическая и биологическая стойкость; .высокая механическая прочность; .достаточная проницаемость; большая удельная поверхность; вместимость, пористость;.возможность получения в виде удобных в технологическом отношении форм (гранулы, мембраны, трубы, листы, кубики и т.д.);.легкое проведение в реакционно-способную форму (активация);.высокая гидрофильность, обеспечивающая возможность проведения реакции связывания фермента с носителем в водной среде; доступность, дешевизна.

Органические полимерные носители

Применяемые в инженерной энзимологии полимерные органические носители можно разделить на 2 больших класса: 1- природные полимеры и 2- синтетические полимерные носители.

Природные носители имеют как преимущества так и недостатки. К недостаткам можно отнести их неустойчивость к воздействию микроорганизмов, довольно высокую стоимость и термофобность.

Полисахариды – наиболее часто для иммобилизации используют полисахариды целлюлозу, декстран, агарозу, каррагинан и их производные.

Целлюлоза - представляет собой поли-1,4-β-D-глюкопиранозин - D-глюкапиранозу. Она обладает высокой гидрофильностью. Присутствие большого количество ОН- групп дает возможность ее легко модифицировать путем введения различных заместителей. Препараты целлюлозы «сшивают» эпихлоргидрином для придания им химической прочности. Для увеличения механической прочности целлюлозу гранулируют в виде пористых сферических гранул. Существует 2 способа гранулирования: осаждение в вводно-органической среде и гидролиз с разрушением аморфных участков. Гранулированную целлюлозу легко превращают в различные ионообменные производные: ДЭАЭ – целлюлоза, КМ-целюлоза и т.д. Недостатки целлюлозы – неустойчива к воздействию сильных кислот, щелочей.

Хитин – основной компонент наружного слоя скелета членистоногих, а также клеточные оболочки некоторых грибов. Является отходом переработки крабов и др. ракообразных.Не растворяется в воде, разбавленных кислотах и щелочах. Модифицируют глутаровым диальдегидом или солями тяжелых метало (титан IV). Хитин можно рассматривать как целлюлозу, в которой СН2ОН – группа заменена ацетамидными остатком.

Декстран – разветвленный полисахарид из бактериальных источников, содержащий остатки глюкозы. Гели на основе декстрана, сшитые эпихлоргидрином выпускаются под названием «сефадекс» и «моноселект». Сефадексы очень гидрофильны. Маркировки G - для воды, LH – для органических растворителей. К декстранам относят крахмал, губчатый крахмал.

Агароза – из-за дороговизны ведут поиск методов модификации с целью обеспечения легкой реакции носителя. Если охладить 2-6% водный раствор агарозы до 450С образуются крупнопористые гели, которые нельзя автоклавировать и высушивать. Различные фирмы выпускают гели на основе агарозы под названием «сефароза», «биогель», «ультрагель».

Агар – компонент клеточных мембран некоторых красных морских водорослей, содержит 2 полисахарида агарозу и агаропектин. Гели получают при охлаждении 2-5% ного горячего водного раствора.

Альгиновые кислоты и их соли альгинаты – альгинат полисахарид основной структурный, бурых морских водорослей. В присутствии моноавлентных катионов полисахарид, даже в низких концентрациях, образует вязкий раствор, а в присутствии 2-х валентных катионов (Са²⁺) наблюдается образование геля.

Каррагинаны – гетерогенные полисахариды. Для иммобилизации используют κ- каррагинан – нерастворимую фракцию, получаемую путем добавления ионов кальция к водному экстракту каррагинана в физиологическом растворе, в присутствии ионов К⁺.

Белки – для иммобилизации используют ограниченно, из-за подверженности воздействию микробами. Вместе с тем белки обладают и рядом преимуществ: образуют очень тонкие пленки (мембраны), обладают значительной вместимостью для ферментов, способны к биодеградации. Наиболее часто в качестве носителей применяют структурные белки кератин, фибрион, коллаген, двигательные – миозин, транспортные – сывороточный альбумин. Кератин, получаемый путем специальной обработки перьев, имеет в своем составе серосодержащую аминокислоту, цистеин, поэтому представляет особый интерес для иммобилизации SH – ферментов. Этот белок нерастворим в воде, слабых кислотах и щелочах, в спирте, эфире, ацетоне.

Синтетические полимерные носители

Большинство синтетических полимерных носителей используемых для иммобилизации ферментов и клеток – полимеры на основе акриловой кислоты. Прежде всего это акриламид – гидрофильный носитель. Обычно ферменты и клетки включают в полиакриламидный гель (ПААГ), который получают при сополимеризации – акриламида со сшивающим агентом N,N – метилен – бис – акриламидом (МБАА). При этом нити акриламида, сшитые МБАА, образуют жесткую и стойкую пространственную сетку геля. ПААГ выпускается рядом иностранных фирм под различными названиями в зависимости от присутствия функциональных групп - энзакрил и др. Чтобы получить реакционно-способные полимеры для ковалентной иммобилизации, вводят активные химические группы в готовый полимер методом химической модификации, или активируют соответствующее функциональное производные мономера. В качестве активаторов чаще применяют цианогалогены. Для получения гелей, обладающих более жесткой и инертной структурой, сшивают носители синтетического и природного происхождения, например, ПААГ и агарозу. Носители на основе синтетических полимеров – акрилов и виде сферических гранул, выпускаемые за рубежом, называются «сферонами».

Среди других синтетических полимерных носителей следует отметить полиамидные носители. Это гетерогенные полимеры с повторяющейся амидной группой – С(О)-NH - , найлон 6, капрон и др. Для использования в качестве носителей полиамиды активируют, частично гидролизуя, с последующей обработкой глутаровым альдегидом. Достоинство носителей этого типа – можно готовить носители в различных формах – гранулы, порошки, волокна, мембраны и т.д.

В последнее время для иммобилизации широко применяют носители на основе поливинилового спирта (ПВС). Гидрофильные гели на основе ПВС получают применяя сшивающие агенты ( ксилендихлорид, хлоргидрин в щелочной среде, глутаровый альдегид в кислой среде или облучают УФ- светом ).

Еще один способ – это получение криогелей без смешивающих агентов.

Удобным материалом для включения ферментов в гель являются гидрофильные полиуретановые полимеры. Во- первых иммобилизация с их использованием легко достигается простым смешиванием полимера и клеток или ферментов без дополнительного нагревания или сдвига рН; во-вторых, гидрофильные исходные полимеры с необходимыми физическими и химическими свойствами могут быть получены в отсутствии ферментов, т.е. исключается инактивация ферментов мономерами.

Часто матрицы сами по себе трудно использовать в качестве факторов способствующих удержанию – фермента или клетки на поверхности носителей. Для того чтобы матрица могла выполнить эту функцию нужно ее активировать, т.е. провести такую химическую реакцию, чтобы на поверхности образовались электрофильные группы, обладающие большой реакционной способностью по отношению к нуклеофильным группам на белке (амино -, карбокси - и ОН – группы). Наиболее эффективными электрофильными группами являются: имидокарбонаты, карбонаты, эпоксиды, активированные двойные связи, активированные атомы галогенов.

Получение этих производных довольно сложный процесс. Для каждого носителя используют свои реагенты в зависимости от наличия в них тех или иных функциональных групп (гидрооксильных, карбоксильных, аминных и др.).

Органические низкомолекулярные носители

Многие ферменты для проявления своей активности нуждаются в присутствии липидов. Кроме того, большинство ферментативных реакций протекают или вблизи биологических мембран, представляющих собой смесь липидов, т.е. иммобилизация фермента на природных липидах это приближение условий функционирования биокатализатора к условиям, близким к естественным. Для этих целей чаще всего применяют фосфолипиды – основные липиды биологических мембран. Фосфолипиды состоят из глицеринового основания, остатка фосфорной кислоты, аминоспирта (полярная головка) и 1 или 2-х радикалов – остатков жирных кислот. Из-за особенности физико-химических свойств, наличия гидрофобных хвостов и гидрофильной головки, фосфолипиды способны образовывать мономолекулярные и бимолекулярные остатки, сферические тела, цилиндры и т.д.

В качестве носителей можно использовать также синтетические аналоги липидов (поверхностно-активные вещества) тритон (полиоксиэтиленалкилфениловые эфиры), твин (оксиэтилированные эфиры ангидросорбита и жирных кислот), бридж (простые эфиры полиоксиэтилена).

Неорганические носители

Из-за легкости регенерации и возможности придания им различных конфигураций неорганические носители находят все больше применение в промышленных процессах. Эти носители применяются в виде порошков, шариков или монолитов. Причем они могут быть пористыми или непористыми. Монолиты чаще всего состоят из большого числа каналов разной формы сечения, отделенных тонкой стенкой. Монолиты оказывают меньшее сопротивление потоку.

Из неорганических носителей чаще всего используют макропористые стекла, силикагель и силохромы (кремнеземы). Они обладают механической прочностью, химически инертны, устойчивы к действию микроорганизмов. Кроме того поры этих материалов обладают достаточной жесткостью. Силикагель аморфное вещество, получаемое из ортокремниевой кислоты поликонденсацией («старение»). Поверхности кремнеземов покрыты гидрофильными группами, обладающие слабыми кислотами свойствами, поэтому они в щелочной среде разрушаются и его можно устранить в органическом диапазоне рН. Но этот недостаток можно устранить, покрывая его поверхность пленками. оксидов металлов (алюминий, титан), полимерами (полиэтиленамин), или обработать солями переходных металлов. Еще одним способом модификации кремнеземов является введение в них различных реакционно-способных групп (-CN, -NO₂, -NH₂ . Для этих целей используют кремнийорганические вещества (γ-аминопропилтриэтоксилан для NH₂), галогеналкилсиланы для СI, сложные эфиры силилкарбоновых кислот для CON₃ и т.д. ).

Среди других неорганических носителей можно отметить – глины, цеаниты, пористую керамику, которые также можно модифицировать.