1.3.3.Фермент-субстратные комплексы и механизм действия ферментов.
Уже исходя из названия фермента можно сказать, что он специфичен, т.е катализирует строго определенные реакции. Это очень важное свойство живых систем, т.к. благодаря этому и возможна тонкая упорядоченность и тесная взаимосвязь отдельных ферментативных реакций – основы биологического обмена веществ. Однако, специфичность у разных ферментов разная. Известны следующие основные виды специфичности:
Абсолютная – фермент катализирует превращение только одного субстрата.
Групповая – фермент действует на разные, но обладающие одинаковыми типами атомных группировок субстраты. Например – пепсин, протеолитический фермент, гидролизует только те пептидные связи, которые образованы ароматическим аминокислотами.
По отношению к определенным типам реакций. Фермент катализирует любые однотипные реакции. Например, липазы осуществляют гидролиз любых сложных эфиров, включая липиды и фосфолипиды. Однако, в зависимости от субстрата, например типа жирных кислот, скорость гидролиза может быть различной.
Стереохимическая (пространственная). Фермент действует только на превращение одной какой – либо стереохимической формы субстрата (£ и D формы субстрата.
Таким образом под специфичностью фермента понимают его способность отличать свой истинный субстрат от других родственных молекул. Такая избирательность обусловлена высокой специфичностью фермент-субстратных взаимодействий и наличием активного центра. Активный центр это особый участок молекулы белка, где может связываться субстрат с образованием фермент-субстратного комплекса (ФСК). Причем, хотя эти остатки пространственно объединены, в линейной последовательности белка они часто стоят далеко друг от друга. Существование ФСК доказано с помощью различных экспериментальных методов, в том числе рентгеноструктурного анализа, спектроскопических методов и электронного парамагнитного резонанса. Он почти всегда построен всего лишь из нескольких аминокислотных остатков. Как правило, формирование ФСК происходит без образования ковалентных связей, а осуществляется за счет слабых, но более специфических типов взаимодействий – водородных связей, солевых мостиков, гидрофобных взаимодействий и т.д. Правда есть исключения, когда между ферментом и субстратом формируются ковалентные связи – некоторые протеазы.
В настоящее время не существует единой теории, объясняющей необычно высокую специфичность и активность ферментных катализаторов. В то же время в отношении небольшого числа конкретных ферментов был выдвинут целый ряд вполне вероятных гипотез, подтвержденных экспериментальными данными. По-видимому, положенные в основу этих гипотез явления в совокупности и обусловливают специфические свойств ферментов. В настоящем разделе мы вкратце рассмотрим некоторые из этих гипотез. Поскольку все рассматриваемые здесь гипотезы только частично объясняют механизм действия ферментов, мы не будем пытаться обобщить эти данные с целью создания единой теории ферментативной активности.
Первая, наиболее известная гипотеза, модель «ключ-замок», была предложена в 90-х годах 20 века Фишером. Согласно этой модели фермент и субстрат обладают жестким структурами, причем фермент подогнан к субстрату как ключ к замку. Однако, эта модель не могла объяснить ряд фактов. Во-первых, конкурентный ингибитор также подходит к ферменту как «ключ» к «замку», но «замок» не открывается, т.е. реакция не идет. Во-вторых, физическими методами было показано, что образование ФСК не статический, а динамический процесс.
В 1959 г. Коштландом была предложена гипотеза индуцированного соответствия. Согласно этой общепринятой гипотезе, связывание своего правильного субстрата индуцирует в белке небольшие конформационные изменения. В результате этого изменения каталитические группы фермента ориентируются таким образом, что становится возможным превращение субстрата в продукт. Причем конформация субстрата, при связывании с ферментом, также изменяется. Возникает напряжение в субстрате, т.е. в этой гипотезе учтены недостатки предыдущей модели.
Для объяснения действия некоторых (гидролитических) ферментов была выдвинута теория деформации субстрата (теория «дыбы» - напряженное состояние). Эта теория объясняет механизм действия и многих лиаз, трансфераз. Рассмотрим гидролиз соединения А-В Рис.1.13). Поверхность фермента имеет углубления в тех участках, где происходит образование ФСК. Причем, соединение возникает не в любом месте молекулы фермента, а лишь в двух определенных точках. К одной точке присоединяется часть А, а к другой – В. Связь А-В растягивается, перемещаются электроны и происходит разрыв, сопровождающийся присоединением Н+ воды к В, а ОН- к А. Может быть и обратная реакция.
Еще одна физическая теория предложена Перутц (Рис.1.14). Автор исходил из того, что: во-первых, молекула фермента, всегда больше молекулы субстрата, за редким исключением; во-вторых, полость фермента, активный центр, преимущественно неполярна (гидрофобна). Неполярная часть белковой молекулы имеет малую диэлектрическую проницаемость, практически отсутствует ЭДС-поляризации обусловленное молекулами воды, что облегчает электрические взаимодействия, т.е. фермент является не только специфическим реагентом, но и средой реакции. Наличие фиксированных зарядов в полости фермента может создать поле напряженностью несколько мВ на 1 нм., а это 100000 В на 1 см. Химическая связь, попадая в это поле может легко разорваться, а в присутствии большого количества молекул воды, это не было бы возможным.
Некоторые ферменты осуществляют реакции, хорошо известные в химии. Одной из таких реакций является общий кислотно-основной катализ, в котором катализатор на одной из стадий процесса захватывает или отдает протон. Этот тип катализа, в частности, лежит в основе механизма действия одного из немногих ферментов, для которых предложена достаточно убедительная полная последовательность элементарных стадий каталитического процесса. Выделяемый из поджелудочной железы химотрипсин представляет собой протеолитический (т. е. гидролизующий белки) фермент, специфично расщепляющий пептидные связи, образованные карбоксильными группами остатков тирозина, триптофана и фенила-ланина. Считается, что в реакции химотрипсинового катализа как при отщеплении, так и при присоединении протонов роль переносчика последних играет вода. В сущности, к общему кислотно-основному катализу можно свести целый ряд очень важных в химии клетки реакций, в том числе процессы присоединения к карбонильным соединениям и гидролиз сложных эфиров.
В ферментативном катализе важную роль могут играть и другие факторы, например ковалентный катализ, деформация связей, электростатический катализ, многофункциональный катализ и эффекты растворителя. Детальное описание этих эффектов можно найти в приведенной в специальной литературе, вероятно они, как и рассмотренные в настоящем разделе факторы, могут оказывать влияние на некоторые катализируемые ферментами реакции. Поскольку в общем случае реакции ферментативного катализа включают в себя множество эффектов неудивительно, что пока еще не удалость разработать простую общую схему, которая позволила бы оценить их суммарное влияние и относительную значимость каждого из них. К счастью, математические выражения для скоростей катализируемых ферментами реакций можно вывести, опираясь лишь на основную концепцию о фермент-субстратном комплексе как основном промежуточном соединении.