- •Глава 1.
- •1.1.1 Предмет и задачи ферментного катализа и инженерной энзимологии
- •1.1.2. Первичная структура белка
- •1.1.3. Основы термодинамики. Типы связей в белках и энергетика.
- •1.1.4. Конформация пептидов. Вторичная структура белков
- •1.1.5. Структура глобулярных белков. Третичная и четвертичная структура.
- •1.2.2. Методы выделения и очистки ферментов
- •1.2.3. Единицы активности ферментов. Методы определения активности ферментов.
- •1.3.1.Класссификация ферментов.
- •1.3.2.Коэнзимы и другие кофакторы
- •1.3.3.Фермент-субстратные комплексы и механизм действия ферментов.
- •1.3.4.Кинетика ферментативных реакций.
- •1.3.5. Влияние температуры на ферментативные реакции.
- •1.3.6. Влияние рН на ферментативные реакции.
- •14.1. Эффекторы ферментов. Механизмы регуляции ферментных реакций.
- •1.4.2 Механизмы конкурентного ингибирования ферментативных реакций.
- •1.4.3. Механизмы неконкурентного (аллостерического) ингибирования ферментных реакций.
- •1.4.4.Кинетика ферментных реакций при конкурентном ингибировании.
- •1.4.5. Экспериментальная оценка кинетических параметров ферментативных реакций при полном конкурентном ингибировании
- •1.4.6. Кинетика ферментативной реакций при неконкурентном ингибировании.
- •1.4.7. Экспериментальная оценка кинетических параметров ферментативных реакций при полном неконкурентном ингибировании.
- •1.4.8. Субстратное торможение.
- •Глава 2.
- •2.1.Носители для иммобилизации ферментов и клеток
- •2.2.1.Физические методы иммобилизации ферментов
- •2.2.2. Химические методы иммобилизации
- •2.3.1. Гидролитические ферменты
- •2.3.2. Применение лиаз.
- •2.3.3. Применение изомераз.
- •2.3.4.Применение оксидоредуктаз.
- •2.4.Применение иммобилизованных ферментов в микроанализе.
- •2.5 Применение иммобилизованных биокатализаторов в медицине
2.3.2. Применение лиаз.
Лиазы – относятся к 4 классу, катализируют отщепление от субстратов той или иной группы (не путем гидролиза) с образованием двойной связи, или, наоборот, присоединение групп к двойным связям. Среди них наибольшее промышленное значение имеют ферменты катализирующие реакции синтеза аминокислот и других органических кислот.
аспартаза- (аспартат-аммиак-лиаза) катализирует реакцию синтеза L-аспарагиновой кислоты из фумаровой кислоты и аммиака. Этот фермент особенно активен у факультативных анаэробных бактерий. Содержится также в бактероидах, находящихся в клубеньках бобовых растений.
Аспартаза катализирует реакцию присоединения аммиака по двойной связи фумаровой кислоты. Катализируемая аспартазой реакция не требует присутствия других кофакторов, кроме ионов двухвалентного магния. Фермент накапливается в клетках бактерий при росте культур на богатых средах, содержащих мясной бульон, пептон, дрожжевой экстракт или набор большого числа аминокислот.
Получение L-аспарагиновой кислоты растворимой и иммобилизванной внутриклеточной аспартазой оказалось неэкономичным, в связи с низкой стабильностью. Поэтому для этих целей используют целые клетки включенные в полимерные гели, в частности в Японии клетки включают в полиакриламидный гель (ПААГ). Время полуинактивации препарата при 370С составляет 120 дней. Для сравнения для иммобилизованной аспартазы – 30 дней. Для иммобилизации 10 кг влажных клеток суспендируют в 40 л физиологического раствора, добавляют 7,5 кг акриламида, 0,4 кг метиленбисакриламида, 5 л 5%-ного диметиламинопропионитрила и 5 л 2,5%- ного персульфата калия. Смесь оставляют на 10-15 мин и образующуюся гель формируют в кубики размером 2-3 мм.
Исходным сырьем для синтеза L-аспарагиновой кислоты служит фумарат аммония. Раствор фумарата аммония в концентрации 1М/л, содержащий 0,001 М/л хлористого аммония, пропускают при рН 8,5 и 370С через колонку с иммобилизованными клетками со скоростью потока 0,6 об/ч. рН полученного на выходе 2400л раствора доводят до 2,8 добавлением 60%-ного раствора серной кислоты при температуре 900С, затем охлаждают до 150С и выдерживают 2 ч. Кристаллизирующуюся аспарагиновую кислоту собирают центрифугированием и промывают водой.
В России разработаны и испытаны на пилотной установке биокатализаторы полученные иммобилизацией клеток E.Coli -85 с аспартазной активностью в гель каррагтнана и альгината кальция.
фумараза – (фумарат-гидротаза) катализирует реакции синтеза L-яблочной кислоты из фумаровой кислоты и воды. Яблочная кислота находит применение в качестве заменителя лимонной кислоты в продуктах питания и фармацевтических препаратах.
И в этой технологии используют клетки, только с фумаразной активностью, иммобилизованные в ПААГ. Для подавления побочной реакции образования янтарной кислоты, которая с трудом отделяется от непрореагировавшей фумаровой кислоты, иммобилизованные клетки обрабатывают детергантами, например экстрактом желчных кислот в концентрации 0,2%, при 370С, рН 7,5 в течение 20 ч. По спавнению с интактными клетками иммобилизованные клетки существенно стабильнее, и время их полуинактивации составляет около двух месяцев.
В Италии производят иммобилизованную фумаразу, где фермент включен в полые волокна триацетата целлюлозы, с сохранением 40% активности.