Заняття 1

„ЖИТТЄВИЙ ЦИКЛ КЛІТИН. МІТОЗ.”

План:

1. Виготовлення тимчасових препаратів корінців проростків, пофарбованих ацетокарміном

2. Визначення рівня мітотичної активності мерістематичної тканини

Мета:

Навчитися фіксувати і фарбувати хромосоми в клітинах рослинних мерістематичних тканин, що активно діляться, розрізняти фази мітозу в клітинах корінців проростків різних сільськогосподарських культур та розраховувати мітотичний індекс;

Матеріали, обладнання та реактиви: 1) корінці 5-ти денних проростків різних сільськогосподарських культур, фіксовані протягом 24 годин через кожні 2 години; 2) спирто-оцтовий фіксатор (спирт 96 % - 3 частини, крижана оцтова кислота – 1 частина); 3) ацетокармін (1 % розчин карміну на 45 % оцтовій кислоті; кип'ятиться протягом 3-4 годин, після чого фільтрується гарячим); 4) 70 % етиловий спирт; 5) дистильована вода; 6) мікроскопи; 7) предметні і покривні скельця; 8) препарувальні голки і пінцети; 9) фільтрувальний папір; 10) окуляр-мікрометр; 11) спиртівки; 12) 45 % оцтова кислота; 13) загострені сірники.

При проведенні цитогенетичних робіт дуже часто необхідно врахувати рівень мітотичної активності досліджуваних тканин. Для цього підраховують мітотичний індекс (МІ), який визначають за відношенням кількості клітин у стані мітозу до загальної кількості проаналізованих клітин та виражають у проміле (%₀ ) – тисячних частках цілого.

Хід роботи

1. Виготовлення тимчасових препаратів корінців проростків, пофарбованих ацетокарміном

Корінці 5-ти денних проростків різних сільськогосподарських культур, фіксують протягом 24 годин через кожні 2 години в спирто-оцтовому фіксаторі. Через 6-10 годин проростки переносять в 70 % етиловий спирт, де фіксований матеріал може знаходиться досить тривалий час.

Потім корінці поміщають на предметне скло в краплю ацетокарміну і підігрівають над полум'ям спиртівки майже до кипіння. Після цього корінець поміщають на нове предметне скло в свіжу порцію барвника і відрізують кінчик (зона поділу) корінця. Препарат накривають покривним склом і рівномірно розподіляють матеріал постукуванням по покривному склу загостреним сірником.

Через 10-15 хвилин замінюють розчин ацетокарміну під покривним склом на 45 % розчин оцтової кислоти для фарбування цитоплазми і додаткової мацерації. Заміну проводять таким чином: з одної сторони від покривного скла капають краплю 45 % оцтової кислоти, а з другого боку шматочком фільтрувального паперу відсмоктують ацетокармін, при цьому 45 % розчин оцтової кислоти поступає під покривне скло і вимиває барвник з цитоплазми клітин корінців, хромосоми залишаються забарвленими. Цю процедуру повторюють кілька разів, доки барвник повністю не вимиється з препарату.

Після цього препарат розглядають під мікроскопом при збільшенні об'єктиву 40 або 90. В останньому випадку використовують імерсійне масло.

2. Визначення рівня мітотичної активності мерістематичної тканини

Ознайомлення з фазами клітинного поділу проводиться на постійних препаратах корінців цибулі. Перед проведенням підрахунків потрібно навчитись розрізняти клітини, які знаходяться на різних фазах мітозу, від клітин, які не діляться, клітини зони поділу, від клітин інших зон за формою та розмірами.:

Препарат спочатку розглядають при малому збільшенні мікроскопу (об‘єктив 10).

На кінчику кореня добре помітний чохлик, який захищає конус наростання від ушкодження під час росту в ґрунті. Алі знаходиться конус наростання, або зона поділу клітин (приблизно 2 мм). Меристема складається з декількох шарів клітин прямокутної форми. За конусом наростання знаходиться зона розтягу, де клітини витягуються у довжину. А потім зона всасування з кореневими волосками.

Мітоз вивчають на меристематичних клітинах конусу наростання кореня. Після ознайомлення з коренем при малому збільшенні, препарат розглядають під об‘єктивом 40. Підрахунок клітин на різних фазах мітотичного циклу проводять у декількох полях зору таким чином, щоб загальна кількість досліджуваних клітин становила не менше 500 штук.

Клітини на різних стадіях мітотичного циклу характеризують наступним чином:

1. клітини у стадії інтерфази. Це клітини, які не діляться та мають чотирьохкутну форму і оточені темними, добре помітними оболонками. Вони містять округлі або овальні ядра з одним або двома ядерцями і забарвлені зерна хроматину;

2. клітини у стадії профази – в ранній профазі – в ядрі з'являються нитчасті структури, які скатані у вигляді щільного клубка; потім структури спіралізуються, коротшають і відособляються. У кінці профази оболонка ядра і ядерця зникають; помітні окремі хромосоми, що лежать в цитоплазмі;

3. клітини у стадії метафази – хромосоми розташовуються по екватору і мають вид товстих зігнутих паличок. В деяких клітинах хромосоми виглядають подвійними, тобто вони виглядають у вигляді пар хроматид;

4. клітини у стадії анафази – сестринські хромосоми розходяться до різних полюсів, завдяки скороченню ниток веретен, що тягнуть. На кожному полюсі буде стільки ж хромосом, скільки мала материнська клітина. На зрізі знайти пізні і ранні анафази, які відрізняються різною відстанню хромосом від екватора клітини;

5. клітини у стадії телофази – зникнення чіткого контуру хромосом і утворення яскраво забарвленого рихлого клубка. В клітинах з більш пізньою телофазою можна знайти нові ядра і перегородку, яка розділяє клітину на дві частини.

Оримані дані занести у таблицю 1.1:

Таблиця 1.1

Номер поля зору під мікроскопом	Кількість клітин в стані:
	Профази (П)	Метафази (М)	Анафази (А)	Тілофази (Т)	Інтерфази (І)	Разом

І. Визначити мітотичний індекс за формулою:

(‰)

ІІ. Визначити відносну тривалість кожної фази мітозу (%) за формулами:

1. тривалість профази:

2. тривалість метафази:

3. тривалість анафази:

4. тривалість телофази:

5. тривалість інтерфази:

ІІІ. Визначити кількість хромосом у даної культури на стадії метафазної пластинки

Завдання: визначити мітотичний індекс, тривалість інтерфази відносно усього життєвого циклу клітини та тривалості різних фаз мітозу: профази, метафази, анафази та телофази.