Лекция 3

Методы детекции биополимеров.

Спектрофотометрия

Основан на детекции флуоресценции.

Недостаток радиоактивных меток – невозможно контролировать испускание электронов; флюоресценция возбуждается квантами света, соответственно, можем запустить процесс, когда нам это удобно.

Сейчас практически все приборы, включая приборы массового параллельного секвенирования работают на спектрофотометрических принципах.

Достоинства спектрофотометрии::

• свет легко генерировать и регистрировать;

• возможность управлять временем и местом регистрации;

• высокая точность измерения интенсивности сигнала;

Недостатки :

• малая избирательность регистрации (изменение субстратной специфичности);

• немногие молекулы или группы атомов обладают выраженными оптическими свойствами; метки для биополимеров на их основе имеют значительные размеры, не являются химически нейтральными и значительно меняют физико-химические свойства биополимеров;

Иногда метка в несколько раз больше мишени. Метка даже может поменять растворимость вещества. Соответственно, никаких шансов проследить судьбу отдельных атомов, что позволено с использованием сцинтилляторов.

Методы использования флуоресцентных меток и радиоизотопов в некотором смысле комплементарны.

Детекция – во время облучения светом.

Для некоторых полимеров есть возможность исследовать и регистрировать самофлюоресценцию – можно обойти ограничение на встраивание здоровенных меток. Но для ограниченного числа:

• например, для белков с триптофаном

Изучение оптических свойств биополимера дает возможность изучить количество и состав б/п.

Поглощение света веществом

Исследуем оптические свойства б/п, безо всяких меток. Доя некоторых б/п, имеющих выраженные оптические свойства.

1. Источник света, желательно монохроматический, и чтобы мы могли задавать длину волны; тогда мы можем получить спектр поглощения, т.е, зависимость интенсивности поглощения от длины волны.

2. оптическая ситема, которая обеспечивает падение лучей под прямым углом (параллельный поток)

3. параллельный поток света падает на раствор биополимера.

4. после прохождения определенного расстояния в растворе свет попадает на детектор

Коэффициент пропускания : T = I / I₀ (%) – доля света, которая попала на детектор, при интенсивности, которую обеспечивает источник света.

Величина неудобная, неудобна для оценки концентрации – не пропорционально концентрации.

• величина обратная количеству вещества (толщине слоя) величина - - замена на 1 / T;

• величина неаддитивная (мультипликативная) от количества вещества (толщины слоя) величина – переход к log шкале

T₁ = I₁/I₀ T₂ = I₂/I₁ T = I₂/I₀ ==> T = T₁*T₂

lg(T) = lg(T₁)+lg(T₂)

- замена lg(T) для получения аддитивной величины

Закон Ламберта-Бера

D = lg ( 1 / T ) = ε C l

D – оптическая плотность (безразмерна, у.е), ε - молярный коэффициент экстинкции (М-1см-1), l – длина светового пути, С – концентрация вещества, встретившегося на пути.

D может использоваться как мера

• концентрации ( l = 1cm) вещества;

• количества ( l = 1cm, v = 1cm3) вещества;

Но чтобы использовать как меру концентрации, надо договориться о стандартной длине светового пути.

Кроме того, чтобы использовать как меру количества вещества, надо знать стандартный объем, в котором необходимо растворить сухой порошок. Исторически сложилось, что это см³, что не очень удобно, так как надо все время помнить о коэффициенте 10³.

Почему см² а не литр? Потому что первые кюветы были именно такие.

Так как D – логарифмическая величина, точность ее измерения зависит от диапазона значений измерения. (важно понимать для того, чтобы выбрать лучший спектрофотометр)

Если D → 0, то вещество прозрачно (хорошее стекло должно иметь такое D); при измерении очень малых оптических плотностей но тогда измеряем в сущности не опт. плотность в-ва, а нестабильность источника света. Даже воздух имеет D ≠ 1, что вносит серьезные погрешности.

D=1 означает, что 1/10 падающего света попадет на детектор, D=2 – что 1/100 попадет на детектор. Погрешность носит нестабильность источника, коэф. пропускания других компонентов системы. Появляется системная ошибка, относительная ошибка сильно увеличивается.

Коэф пропускания: 0 – 1, D – от 0 до ∞.

Относительная ошибка : отношение абс. погрешности к измеренной величине.

В области больших плотностей (D=1 и выше) другая проблема – шум детектора, который должен зарегистрировать очень слабый свет. Как бороться? Бесконечно увеличивать мощность падающего света нельзя, так как возможны даже химические изменения в-ва; соответственно, повышаются требования к детектору. Хотя проще разбавить вещество.

Оптимальный дипазон измерения – от 0.1 до 2.