Рекомбинантные белки, синтезируемые в системах экспрессии Saccharomyces cerevisiae
Вакцины |
Поверхностный антиген вируса гепатита В |
Белок малярийного плазмодия |
Белок оболочки HIV-1 (вирус иммунодефицита человека 1 типа) |
Диагностика |
Белок вируса гепатита С |
Антигены HIV-1 |
Лекарственные вещества |
Фактор роста эпидермиса |
Инсулин |
Инсулиноподобный фактор роста |
Тромбоцитарный фактор роста |
Проинсулин |
Фактор роста фибробластов |
Колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов |
а-Антитрипсин |
Фактор ХIIIа системы свёртывания крови |
В 2005 г. общее число биотехнологических фирм в США, по оценке экспертов издания «MedAdNews», достигло 500, причем отмечена тенденция к созданию интегрированных крупных биофармацевтических фирм и их отделений. Разработка противоопухолевых лекарственных средств является приоритетным направлением биотехнологических исследований в США. Около 60% препаратов из общего количества разрабатываемых биотехнологических средств предназначено для лечения рака или связанных с ним проблем. 18 генно-инженерных препаратов, находящихся на разных стадиях клинических исследований, являются потенциальными средствами для лечения СПИДа и профилактики ВИЧ-инфекции.
Предполагалось, что с помощью новой технологии можно будет получать весь спектр лекарственных препаратов в количествах, достаточных для их эффективного тестирования и для применения в клинике. Эти ожидания оправдались. На сегодняшний день клонировано более 400 генов различных белков человека, которые могут стать лекарственными препаратами. Большинство этих генов экспрессированы в клетках-хозяевах, и их продукты прошли и проходят проверку на возможность применения для лечения различных заболеваний человека. Свыше 30 биотехнологических препаратов прошли проверку и одобрение Департамента по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств США (FDA) (Табл. 2).
Генная инженерия белков-ферментов
Технология рекомбинантных ДНК позволяет выделять гены любых белков, существующих в природе, экспрессировать их в специфическом хозяйском организме и получать чистые белковые продукты. Однако физические и химические свойства таких «природных» белков часто не удовлетворяют условиям, обеспечивающим возможность их промышленного применения. Иногда для получения белков, обладающих нужными свойствами, в качестве источника соответствующих генов используют организмы, растущие в необычных, зачастую экстремальных условиях. Для получения белков с заранее заданными свойствами можно использовать также мутантные формы генов. Однако число мутантных белков чрезвычайно велико. Мутагенез с последующим отбором редко приводит к существенному улучшению свойств исходного белка, поскольку большинство аминокислотных замен сопровождается снижением активности фермента.
Для создания белков со специфическими свойствами можно использовать другой подход, основанный на внесении изменений в кодирующие их клонированные гены. Это позволяет получать белки с другими, чем у их аналогов, свойствами.
На долю 20 из многих тысяч изученных и охарактеризованных ферментов приходится более 90% всех ферментов, используемых в настоящее время в промышленности (размягчение мяса, пивоварение, производство спирта, осветление соков и т.д.).
Остальные ферменты не используются потому, что присущая им активность не удовлетворяет требованиям, предъявляемым высокоспециализированными процессами, протекающими in vitro. Большинство ферментов быстро денатурируют при высокой температуре и в присутствии органических растворителей, а именно в этих условиях протекают многие промышленные процессы. Термостабильные ферменты можно выделить из термофильных микроорганизмов, однако эти организмы не всегда синтезируют именно те специфические ферменты, которые необходимы. Поэтому эти трудности преодолевают при помощи направленного мутагенеза и клонирования генов-мишеней.
Б) Генную терапию на современном этапе можно определить как лечение наследственных, мультифакториальных и ненаследственных (инфекционных) заболеваний путем введения генов в клетки пациентов с целью направленного изменения генных дефектов или придания клеткам новых функций. Первые клинические испытания методов генной терапии были предприняты 22 мая 1989 года с целью генетического маркирования опухоль-инфильтрующих лимфоцитов в случае прогрессирующей меланомы. Первым моногенным наследственным заболеванием, в отношении которого были применены методы генной терапии, оказался наследственный иммунодефицит, обусловленный мутацией в гене аденозиндезаминазы (ADA).
МЕТОДЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТРАНСФЕКЦИИ В ГЕННОЙ ТЕРАПИИ
Решающим условием успешной генотерапии является обеспечение эффективной доставки, то есть трансфекции (в широком смысле) или трансдукции (при использовании вирусных векторов) чужеродного гена в клетки-мишени, обеспечение длительного функционирования его в этих клетках и создание условий для полноценной работы гена (его экспрессии). Трансфекция может проводиться с использованием чистой ("голой" — naked) ДНК, легированной (встроенной) в соответствующую плазмиду, или комплексированной ДНК (плазмидная ДНК, соединенная с солями, белками (трансферрин), органическими полимерами (DEAE-декстран, полилизин, липосомами или частицами золота), или ДНК в составе вирусных частиц, предварительно лишенных способности к репликации.
Основные методы доставки чужеродных генов в клетки разделяются на химические, физические и биологические. Эффективность трансфекции и интеграционная способность трансдуцированной чужеродной ДНК при различных способах трансфекции в ДНК-клетки мишени неодинакова. Только вирусные векторы или генетические конструкции, включающие вирусные последовательности, способны к активной трансдукции, а в некоторых случаях и к длительной экспрессии чужеродных генов. Из более 175 уже одобренных протоколов клинических испытаний по генотерапии более 120 предполагают использовать вирусную трансдукцию и около 100 из них основаны на применении ретровирусных векторов.
Обзор данных позволяет прийти к заключению, что, несмотря на усилия многих лабораторий мира, все уже известные и испытанные in vivo и in vitro векторные системы далеки от совершенства. Если проблема доставки чужеродной ДНК in vitro практически решена, а ее доставка в клетки-мишени разных тканей in vivo успешно решается (главным образом путем создания конструкций, несущих рецепторные белки, в том числе и антигены, специфичные для тех или иных тканей), то другие характеристики существующих векторных систем – стабильность интеграции, регулируемая экспрессия, безопасность – все еще нуждаются в серьезных доработках.
Прежде всего это касается стабильности интеграции. До настоящего времени интеграция в геном достигалась только при использовании ретровирусных либо аденоассоциированных векторов. Повысить эффективность стабильной интеграции можно путем совершенствования генных конструкций типа рецептор-опосредованных систем, либо путем создания достаточно стабильных эписомных векторов (то есть ДНК-структур, способных к длительной персистенции внутри ядер).
Рецептор-опосредованный перенос генов заключается в следующем. ДНК-последовательность нужного гена соединяют с определенным веществом (например, гликопротеином), который обладает высоким сродством к определенному мембранному рецептору трансформируемой клетки (например, гепатоцита). Полученный комплекс соединяют с аденовирусом, обеспечивающим проникновение генной конструкции в ядро клетки. Такой комбинированный вектор обеспечивает эффективную адресную доставку гена в определенные клетки.
В последнее время особое внимание уделяется созданию векторов на базе искусственных хромосом млекопитающих (Mammalian Artificial Chromosomes). Благодаря наличию основных структурных элементов обычных хромосом такие мини-хромосомы длительно удерживаются в клетках и способны нести полноразмерные (геномные) гены и их естественные регуляторные элементы, которые необходимы для правильной работы гена, в нужной ткани и в должное время.
ПРИНЦИПЫ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ
В зависимости от способа введения экзогенных ДНК в геном пациента генная терапия может проводиться либо в культуре клеток (ех vivo), либо непосредственно в организме (in vivo). Клеточная генная терапия или терапия ех vivo предполагает выделение и культивирование специфических типов клеток пациента in vitro, введение в них чужеродных генов (например, усиливающих иммунный ответ организма), отбор трансфецированных клонов клеток и реинфузию (введение) их тому же пациенту. В настоящее время в большинстве допущенных к клиническим испытаниям программ генной терапии используется именно этот подход.
Генная терапия in vivo основана на прямом введении клонированных и определенным образом упакованных последовательностей ДНК в специфические ткани больного. Особенно перспективным для лечения генных болезней in vivo представляется введение генов с помощью аэрозольных или инъецируемых вакцин. Аэрозольная генотерапия разрабатывается, как правило, для лечения пульмонологических заболеваний (муковисцидоз, рак легких).
Разработке программы генной терапии предшествуют тщательный анализ тканеспецифической экспрессии соответствующего гена, идентификация первичного биохимического дефекта, исследование структуры, функции и внутриклеточного распределения его белкового продукта, а также биохимический анализ патологического процесса. Все эти данные учитываются при составлении соответствующего медицинского протокола. Апробацию процедуры генокоррекции наследственного заболевания проводят на первичных культурах клеток больного, в которых в норме функционально активен данный ген. На этих клеточных моделях оценивают эффективность выбранной системы переноса экзогенной ДНК, определяют экспрессию вводимой генетической конструкции, анализируют ее взаимодействие с геномом клетки, отрабатывают способы коррекции на биохимическом уровне.
Используя культуры клеток, можно разработать систему адресной доставки рекомбинантных ДНК, однако проверка надежности работы этой системы может быть осуществлена только на уровне целого организма. Поэтому такое внимание в программах по генной терапии уделяется экспериментам in vivo на естественных или искусственно полученных моделях соответствующих наследственных болезней у животных. Успешная коррекция генетических дефектов у таких животных и отсутствие нежелательных побочных эффектов генной терапии являются важнейшей предпосылкой для разрешения клинических испытаний.
Таким образом, стандартная схема генокоррекции наследственного дефекта включает серию последовательных этапов. Она начинается созданием полноценно работающей (экспрессирующейся) генетической конструкции, содержащей смысловую (кодирующую белок) и регуляторную части гена. На следующем этапе решается проблема вектора, обеспечивающего эффективную, а по возможности и адресную доставку гена в клетки-мишени. Затем проводится трансфекция (перенос полученной конструкции) в клетки-мишени, оценивается эффективность трансфекции, степень коррегируемости первичного биохимического дефекта в условиях клеточных культур (in vitro) и, что особенно важно, in vivo на животных — биологических моделях. Только после этого можно приступать к программе клинических испытаний.
В) Моноклональные антитела — антитела, вырабатываемые иммунными клетками, принадлежащими к одному клеточному клону, то есть произошедшими из одной плазматической клетки-предшественницы. Моноклональные антитела могут быть выработаны против почти любого природного антигена (в основном белки и полисахариды), который антитело будет специфически связывать. Они могут быть далее использованы для детекции (обнаружения) этого вещества или его очистки. Моноклональные антитела широко используются в биохимии, молекулярной биологии и медицине. В случае их использования в качестве лекарства его название оканчивается на -mab (от английского «monoclonal antibody»). Перспективным лекарственным средством на основе моноклональных антител является Ипилимумаб или иначе Ервой, использующийся для лечения меланомы.
Человеческие моноклональные антитела имеют различные способы применения. Теория позволяет выращивать данные антитела из полученных в лабораторных условиях В-лимфоцитов. К сожалению, на практике это довольно сложно, поскольку клоны человеческих В-лимфоцитов довольно трудно поддерживаются в культуре в условиях лаборатории. Более простой путь – воздействие интересующим антигеном на мышей, либо крыс, в результате чего развиваются клоны В-лимфоцитов, которые образуют необходимые антитела. Сложилась практика, когда для коммерческого получения моноклональных антител используют комбинацию клеток мыши, либо крысы с клетками человека. Такую комбинацию называют гибридома.
К сожалению, получение антител посредством гибридом является процессом дорогостоящим и длительным. Поэтому современная биоинженерия научилась получать многие моноклональные антитела, пользуясь клетками яичника китайского хомячка, так называемые СНО-клетки. На сегодняшний день, данный вариант признан лучшим в производстве моноклональных антител биоинженерного типа, хотя и он не лишен недостатков. Дело в том, что в получаемых данным способом моноклональных антителах фрагментарно присутствуют антигены, распознаваемые организмом человека как чужеродные, следствием чего является их отторжение.
Генными инженерами разработан еще один подход, значительно увеличивший терапевтические возможности моноклональных антител. Пользуясь техникой рекомбинантных ДНК, ученые сумели принудить клетки грызунов к выработке антител с человеческими Fc-фрагментами. Дело в том, что провоцирующие процессы отторжения чужеродных антител антигены находятся именно в Fc-фрагментах. Полученные таким способом антитела принято называть химерными. Применение химерным антителам нашли при лечении, преимущественно, раковых (онкологических) и иммунных заболеваний.
Следующим шагом было получение «гуманизированных» моноклональных антител, являющих собой антитела грызунов, в которых большая часть структур Fc-фрагмента заменена соответствующими структурами человека, такое стало возможно благодаря успехам генной инженерии.
ДИАГНОСТИКА БОЛЕЗНЕЙ. Одной из самых распространенных болезней, передаваемых половым путем, является хламидиоз. Возбудитель болезни — небольшая грамотрицательная бактерия Chlamydia — необычна тем, что является внутриклеточным паразитом. Симптомы заражения очень слабо выражены, поэтому иногда его трудно отличить от гонореи, другого распространенного заболевания, передающегося половым путем. Обе инфекции могут вызывать у женщин воспалительный процесс в области таза, если они распространяются через матку в фаллопиевы трубы. Болезнь выражается в болях и дискомфорте и может привести к бесплодию. Пока не было моноклональных антител, диагностировать хламидиоз было очень трудно. С использованием моноклональных антител диагностика обеих болезней стала более быстрой и надежной. Результаты можно получить в течение 15—20 мин, что существенно быстрее, чем лабораторный анализ в больницах, занимающий несколько дней.
Другой пример использования моноклональных антител — набор для диагностики стрептококковых инфекций горла. С помошью такого набора участковые врачи могут быстро диагностировать заболевание и назначить лечение. Раньше результатов анализа в лабораториях приходилось ждать несколько дней.
В настоящее время получены моноклональные антитела, способные отличать вирус герпеса 1-го типа, который вызывает простудные поражения кожи на губах, от близкородственного вируса герпеса 2-го типа, вызывающего гени-тальные инфекции. Около 10—12% генитальных инфекций вызываются тем не менее вирусом герпеса 1-го типа. Поскольку способы лечения инфекций, вызываемых разными типами вирусов, существенно различаются, важно уметь отличать один вирус от другого. В этом случае тестирование также занимает около 15—20 мин.
Один из волнующих аспектов диагностики с помощью моноклональных антител — это исследования, проводимые с целью выявления злокачественных заболеваний на более ранних стадиях. Лейкозы и лимфомы обусловлены злокачественным поражением лимфоцитов, и часто их трудно отличить друг от друга. В настоящее время появилась возможность ранней и точной диагностики обоих заболеваний, позволяюшая распознавать разные антигены этих клеток. Лечение рака на ранних стадиях существенно повышает шансы больного на выживание.
Проводится также работа по ранней диагностике наиболее распространенных раковых заболеваний, таких как рак легких, молочной железы, толстой кишки и прямой кишки. В настоящее время чаще всего исследуют жидкое содержимое, например образцы крови или жидкости, окружающей легкие. Разрабатываются также методы идентификации опухолей непосредственно в теле больного. Один из таких методов основан на добавлении радиоактивного изотопа, например иода-131, к моноклональному антителу, которое специфично к антигену, связанному с раковой клеткой. Антитела «разыскивают» антигены по всему телу и накапливаются в клетках, содержащих антигены. Определить локализацию таких клеток можно с помощью специального оборудования, чувствительного к радиоактивному излучению изотопа. Со временем этот метод будет использован и для лечения рака, тем более, что радиоактивное излучение можно использовать для уничтожения раковых клеток.
Г)Стволовые клетки — иерархия особых клеток живых организмов, каждая из которых способна впоследствии изменяться (дифференцироваться) особым образом (то есть получать специализацию и далее развиваться как обычная клетка). Стволовые клетки способны асимметрично делиться, из-за чего при делении образуется клетка, подобная материнской (самовоспроизведение), а также новая клетка, которая способна дифференцироваться.
Самый богатый источник стволовых клеток (СК) - это ткань эмбриона. Когда оплодотворенная яйцеклетка начинает делиться, образуются первые тотипотентные стволовые клетки, которые могут превращаться в любую ткань. Примерно через четыре дня они начинают «специализироваться» (дифференцироваться) и становятся плюрипотентными стволовыми клетками, которые могут превращаться в не менее чем две возможные ткани (например, костную и мышечную). Со временем они становятся еще более специализированными стволовыми клетками - мультипотентными, из которых могут образовываться 2-3 вида клеток (из одних - различные клетки крови, из других - нервной системы и т. д.).
СК могут при необходимости могут трансформироваться в любую нужную клетку. Предположим, человек имеет несколько заболеваний. Каждый орган сигнализирует о своем нездоровье и посылает сигналы СОС. Когда СК попадают в организм, они улавливают эти сигналы и устремляются туда, где они нужны больше всего. СК - это клетки скорой помощи. Что они делают? Они создают новые клетки того органа, к которому пришли на помощь, или способствуют восстановлению поврежденных. Попадая в поражённое инфарктом сердце, они преобразуются в клетки сердечной мышцы, в поражённом инсультом головном мозгу - в нейроны и глиальные клетки. Стволовые клетки могут превращаться в клетки печени, костного мозга и т. д. При помощи клеточной терапии появилась возможность излечения огромного количества самых различных заболеваний.
Известно, что в процессе старения количество стволовых клеток в тканях снижается. Когда мы рождаемся, у нас в костном мозге на сто тысяч кроветворных клеток приходится десять стволовых, к 50-ти годам на миллион – две-три стволовых, а к 70 годам – в лучшем случае - одна на миллион. Из-за этого возможности человека по регенерации сильно ограничены. В результате страдает способность ткани к физиологической регенерации и к восстановлению после болезни или травмы. Результатом трансплантации стволовых клеток является значительное повышение регенераторных и адаптивных возможностей организма. Вызываемое этими клетками "обновление" организма может препятствовать развитию процессов, ведущих к старению. Отсюда перспективность и целесообразность использования клеточных технологий в лечении целого ряда заболеваний, обусловленных старением организма.
Сегодня клеточная терапия является альтернативой трансплантации органов и тканей человека, а также надежным способом продления молодости, здоровья и долголетия. Прежде всего надо сказать о трансплантации стволовых клеток при онкогематологических заболеваниях. Это зачастую единственный способ лечения лейкозов и других тяжелых заболеваний крови. В неврологии трансплантационная клеточная технология была впервые применена при лечении болезни Паркинсона. Весьма обнадеживающие результаты применения клеточной технологии получены при лечении болезни Хагинтона. Значительный опыт в лечении травматических поражений головного и спинного мозга накоплен в Новосибирском центре иммунотерапии и клеточной трансплантации. Ведущие медицинские центры Москвы, Новосибирска и некоторых других городов уже успешно использует клеточную терапию для лечения отдаленных последствий мозгового инсульта и рассеянного склероза. Было показано, что трансплантация низкодифференцированных клеток во взрослый организм может способствовать восстановлению кровотока за счет роста кровеносных сосудов в ишемизированных органах и тканях.
ЛЕКЦИЯ 7
А) Макронутриенты - пищевые вещества (белки, жиры и углеводы), необходимые человеку в количествах, измеряемых граммами, обеспечивают пластические, энергетические и иные потребности организма.
Макронутриенты:
1. Белок
Белки (протеины, полипептиды) являются макронутриентами, высокомолекулярными органическими веществами. Потребность в белке - это эволюционно сложившаяся доминанта в питании человека, которая обусловлена необходимостью обеспечивать оптимальный физиологический уровень поступления незаменимых аминокислот. Физиологическая потребность в белке для взрослого населения - от 65 до 117 г/сутки для мужчин, и от 58 до 87 г/сутки для женщин.
Белки бывают:
Белок животного происхождения
Белок растительного происхождения
2. Жиры
Жиры (липиды, триглицериды) являются макронутриентами, природными органическими соединениями. Жиры поступают в организм вместе с пищей и являются концентрированным источником энергии (1 г жира при окислении в организме дает 9 ккал). Жиры растительного происхождения имеют различный состав жирных кислот, определяющий их физические свойства и физиолого-биохимические эффекты. Жирные кислоты подразделяются на два основных класса - насыщенные и ненасыщенные. Физиологическая потребность в жирах- от 70 до 154 г/сутки для мужчин и от 60 до 102 г/сутки - для женщин.
Жиры это:
Насыщенные жирные кислоты
Мононасыщенные жирные кислоты
Полинасыщенные жирные кислоты (Омега-6. Омега-3)
Стерины
Фосфолипиды
3. Углеводы
Углеводы (сахариды) — общее название большого класса природных органических соединений, часть из которых является макронутриентами. Само название происходит от слов «уголь» и «вода». Углеводы пищи преимущественно представлены полисахаридами ( крахмал), и в меньшей степени моно-, ди- и олигосахаридами. В 1 г. углеводов при окислении в организме дает 4 ккал. Физиологическая потребность в усвояемых углеводах для взрослого человека составляет 50-60% от энергетической суточной потребности (от257 до 586 г/сутки) Углеводы:
Моно и олигосахариды
Полисахариды
Таким образом, подавляющая масса веществ, получаемых нами с пищей, является макронутриентами.
Микронутриенты - пищевые вещества (витамины, минеральные вещества и микроэлементы), которые содержаться в пище в очень малых количествах - миллиграммах или микрограммах. Микронутриенты не являются источниками энергии, но участвуют в усвоении пищи, регуляции функций, осуществлении процессов роста, адаптации и развития организма.
Микронутриенты:
Витамины (от лат. vita - «жизнь») являются микронутриентами, относятся к незаменимым пищевым веществам, то есть к таким компонентам нашего питания, которые в организме человека не образуются, но без которых он существовать не может. Витамины необходимы для роста и развития организма, нормального существования обмена веществ и всех физиологических процессов, таких как: работа сердца и кровеносных сосудов, мышц, умственной деятельности, гормональной системы и иммунитета. Как микронутриенты, витамины защищают человека от болезней, неблагоприятных факторов внешней среды.
Отсутствие или недостаточное содержание витаминов в продуктах питания, неправильное приготовление пищи вызывает болезни витаминной недостаточности: гиповитаминозы и авитаминозы.
Витамины бывают:
Водорастворимые (витамин С, В1,В2, В6, ниацин, В12, фолаты, пантотеновая кислота, Биотин).
Жирорастворимые ( витамин А, Е, D, К, бета- каротин)
Водорастворимые:
Витамин С – микронутриент, участвующий в окислительно- восстановительных реакциях, функционировании иммунной системы, способствует усвоению железа. Дефицит витамина С приводит к кровоточивости десен, носовым кровотечениям вследствие повышенной проницаемости и ломкости кровеносных капилляров.
Витамин В1(тиамин) – микронутриент, входящий в состав важнейших ферментов углеводного и энергетического обмена, обеспечивающих организм энергией и пластическими веществами, а также метаболизма разветвленных аминокислот. Недостаток витамина В1 ведет к серьезным нарушениям со стороны сердечно-сосудистой, пищеварительной и нервной систем.
Витамин В2( рибофлавин)- микронутриент, участвующий в окислительно- восстановительных реакциях в форме коферментов. Способствует повышению восприимчивости цвета зрительным анализатором и темновой адаптации.
Витамин В6 ( пиридоксин)- участвует в поддержании иммунного ответа, в процессах торможения и возбуждения в центральной нервной системе, способствует нормальному формированию эритроцитов. поддержанию.
Дефицит витамина В6 сопровождается нарушением состояния кожных покровов, снижением аппетита, анемии.
Ниацин – участвует в качестве кофермента в окислительно- восстановительных реакциях энергетического метаболизма. Недостаточное потребление витамина сопровождается нарушением нормального состояния кожных покровов, желудочно-кишечного тракта и нервной системы.
Витамин В12 – играет важную роль в метаболизме и превращениях аминокислот. Недостаток витамина приводит к развитию анемии, тромбоцитопении.
Фолаты- участвуют в метаболизме нуклеиновых и аминокислот. Дефицит ведет к нарушению синтеза нуклеиновых кислот и белка, следствием чего является торможение роста и деления клеток, особенно в быстро профилирующих тканях: костный мозг, эпителий кишечника и др.
Пантотеновая кислота- участвует в белковом, жировом, углеводном обмене, обмене холестерина, синтезе ряда гормонов, гемоглобина, способствует всасыванию аминокислот и сахаров в кишечнике, поддерживает функцию коры надпочечников.
Биотин- участвует в синтезе жиров, гликогена, метаболизме аминокислот. Недостаточное потребление этого витамина может вести к нарушению нормального состояния кожных покровов.
Жирорастворимые витамины:
Витамин А – как микронутриент, играет важную роль в процессах роста и репродукции, дифференцировки эпителиальной и костной ткани, поддержания иммунитета и зрения. Недостаток витамина А ведет к нарушению темновой адаптации ( «куриная слепота»), ороговению кожных покровов, снижает устойчивость к инфекциям.
Бета- каротин- является провитамином А и обладает антиоксидантными свойствами.
Витамин Е – представлен группой токоферолов и токотриенолов, которые обладают антиоксидантными свойствами. Является универсальным стабилизатором клеточных мембран, необходим для функционирования половых желез и сердечной мышцы.
Витамин D – микронутриент, основные функции которого связаны с поддержанием саморегуляции кальция и фосфора, осуществлением процессов минерализации костной ткани. Дефицит витамина D приводит к нарушению обмена кальция и фосфора в костях, усилению деминерализации костной ткани, что приводит к увеличению риска развития остеопороза.
Витамин К – его роль обусловлена участием в модификации ряда белков свертывающей системы крови и костной ткани. Недостаток витамина К приводит к увеличению времени свертывания крови, пониженному содержанию протромбина в крови.
Минеральные вещества
Минеральные вещества относятся к микронутриентам и подразделяются на:
Макроэлементы (кальций, фосфор, магний, калий, натрий, хлориды)
Микроэлементы (железо, цинк, йод, медь, марганец, селен, хром, молибден, фтор).
Значение макро- микро- веществ для организма человека многообразно.
Макроэлементы:
Кальций – выступает регулятором нервной системы, участвует в мышечном сокращении, необходимый элемент в формировании ткани, особенно костной.
Фосфор – принимает участие во многих физиологических процессах, включая энергетический обмен, регуляции кислотно-щелочного баланса, входит в состав фосфолипидов, нуклеотидов, нуклеиновых кислот, участвует в клеточной регуляции путем фосфорилирования ферментов, необходим для минерализации костей и зубов. Дефицит фосфора в организме способен привести к анорексии, анемии и рахиту.
Магний- участвует в синтезе белка, нуклеиновых кислот, обладает стабилизирующим действием для мембран, необходим для поддержания в организме кальция, калия и натрия. Недостаток магния может привести к повышению риска развития гипертонии, болезни сердца.
Калий - это основной внутриклеточный ион, который принимает участие в регуляции водного, кислотного и электролитного баланса, участвует в процессах проведения нервных импульсов, регуляции давления.
Натрий- основной внеклеточный ион, принимающий участие в переносе воды, глюкозы, крови, генерации и передаче электрических нервных сигналов, мышечном сокращении. Недостаточность натрия может выражаться общей слабостью, апатией, головными болями, гипотонией, мышечными подергиваниями.
Хлориды- хлор необходим для образования и секреции соляной кислоты в организме.
Микроэлементы:
Железо - микронутриент, который участвует в транспорте электронов, кислорода, обеспечивает протекание окислительно- восстановительных реакций и активацию перекисного окисления. Недостаток железа приводит к гипохромной анемии, миоглобиндефицитной атонии скелетных мышц, повышенной утомляемости, миокардиопатии, атрофическому гастриту.
Цинк - участвует в процессах синтеза и распада углеводов, белков, жиров, нуклеиновых кислот и в регуляции экспрессии ряда генов. Недостаточное потребление цинка приводит к анемии, вторичному иммунодефициту, циррозу печени, половой дисфункции, наличию пороков развития плода.
Йод – участвует в функционировании щитовидной железы, обеспечивая образование гормонов. Необходим для роста дифференцировки клеток всех тканей организма человека, митохондриального дыхания, регуляции трансмембранного транспорта натрия и гормонов. Недостаток йода приводит к эндемическому зобу с гипотериозом и замедлению обмена веществ, артериальной гипотензии, отставанию в росте и умственном развитии у детей.
Медь – входит в состав ферментов, обладающих окислительно-восстановительной активностью, участвующих в метаболизме железа. Стимулирует усвоение белков и углеводов. Участвует в процессах обеспечения тканей организма человека кислородом. Недостаточность меди может приводить к нарушениям формирования сердечно-сосудистой системы и скелета, развитием дисплазии соединительной ткани.
Марганец - участвует в образовании костной и соединительной ткани. Входит в состав ферментов, включающихся в метаболизм аминокислот, углеводов, катехоламинов. Необходим для синтеза холестерина и нуклеотидов. Недостаток потребления сопровождается замедлением роста, нарушениями в репродуктивной системе, повышенной хрупкостью костной ткани, нарушениями углеводного и липидного обмена.
Селен – незаменимый ( эссенциальный) элемент антиоксидантной защиты организма человека, обладает иммуномодулирующим действием, участвует в регуляции действия тиреоидных гормонов. Дефицит приводит к болезни Кашина- Бека ( остеоартроз с множественной деформацией суставов, позвоночника и конечностей), болезни Кешана ( эндемическая миокардия), наследственной тромбастении.
Хром - участвует в регуляции уровня глюкозы крови, усиливая действие инсулина. Дефицит приводит к снижению толерантности к глюкозе.
Молибден – является составляющей многих ферментов, обеспечивающих метаболизм серосодержащих аминокислот, пуринов и пиримидинов.
Фтор – инициирует минерализацию костей. Недостаточное потребление приводит к кариесу, преждевременному стиранию эмали зубов.
Таким образом, микронутриенты оказываются незаменимыми компонентами жизнедеятельности организма любого живого существа.
Б) Пищевые добавки -- природные, идентичные природным или искусственные вещества, сами по себе не употребляемые как пищевой продукт или обычный компонент пищи. Они преднамеренно добавляются в пищевые системы по технологическим соображениям на различных этапах производства, хранения, транспортировки готовых продуктов с целью улучшения или облегчения производственного процесса или отдельных его операций, увеличения стойкости продукта к различным видам порчи, сохранения структуры и внешнего вида продукта или намеренного изменения органолептических свойств.
Основные цели введения пищевых добавок предусматривают:
1. совершенствование технологии подготовки и переработки пищевого сырья, изготовления, фасовки, транспортировки и хранения продуктов питания. Применяемые при этом добавки не должны маскировать последствий использования некачественного или испорченного сырья, или проведения технологических операций в антисанитарных условиях;
2. сохранение природных качеств пищевого продукта;
3. улучшение органолептических свойств или структуры пищевых продуктов и увеличение их стабильности при хранении.
Применение пищевых добавок допустимо только в том случае, если они даже при длительном потреблении в составе продукта не угрожают здоровью человека, и при условии, если поставленные технологические задачи не могут быть решены иным путем. Обычно пищевые добавки разделяют на несколько групп:
-- вещества, улучшающие внешний вид пищевых продуктов (красители, стабилизаторы окраски, отбеливатели);
-- вещества, регулирующие вкус продукта (ароматизаторы, вкусовые добавки, подслащивающие вещества, кислоты и регуляторы кислотности);
-- вещества, регулирующие консистенцию и формирующие текстуру (загустители, гелеобразователи, стабилизаторы, эмульгаторы и др.);
-- вещества, повышающие сохранность продуктов питания и увеличивающие сроки хранения (консерванты, антиоксиданты и др.). К пищевым добавкам не относят соединения, повышающие пищевую ценность продуктов питания и причисляемые к группе биологически активных веществ, такие как витамины, микроэлементы, аминокислоты и др.
Производство аминокислот относится к одной из наиболее передовых областей биотехнологии. Аминокислоты получают путем химического синтеза или экстракцией из белковых гидролизатов.
Незаменимые аминокислоты могут получаться микробиологическим путем более эффективно, чем путем химического синтеза, так как при биологическом синтезе используемые микроорганизмы образуют аминокислоты в биологически активной L-форме. Как продуценты лизина изучаются Brevibacterium lactofermentum и бактерии рода Corynebacterium, также предложены способы биотехнологического получения изолейцина, треонина при использовании E. coli. Большинство исследованных штаммов микроорганизмов независимо от их систематического положения преимущественно накапливают L-аланин и глутаминовую кислоту. Значительно меньше штаммов и в меньшем количестве выделяют аспарагиновую кислоту, лейцин, валин, изолейцин, лизин.
С помощью микроорганизмов можно получить до 60 органических кислот. Многие из них получаются в промышленном масштабе - итаконовая, молочная, уксусная, лимонная, яблочная, янтарная. Эти пищевые кислоты используются как регуляторы кислотности и консерванты. Лимонную кислоту получают с помощью Yarrowia lipolytica, Aspergillus niger, молочную – Endomycopsis fibuligera, Rhisopus oryzae,
Lactobacillus casei, янтарную – Anaerobiospirillum succiniproducens. Уксусную кислоту получают путем микробиологической конверсии водорода и углекислого газа бактериями Acetobacterium woodi и Clostridium aceticum.
Микроорганизмы содержат много витаминов, которые чаще всего входят в состав ферментов. Состав и количество витаминов в биомассе зависят от биологических свойств данной культуры микроорганизмов и условий культивирования. Некоторые витамины микроорганизмы синтезируют, другие напротив усваивают в готовом виде из окружающей среды. Культура, способная синтезировать какой-либо витамин, называется автотрофной по отношению к нему, если культура не способна синтезировать данный витамин, она является авто-гетеротрофной.
Витамины синтезируют в основном химическим путем или получают из естественных источников. Однако эргостерин, рибофлавин (В2), витамин В12 и аскорбиновую кислоту (микроорганизмы используются как селективные окислители сорбита в сорбозу при производстве витамина С) получают микробиологическим путем. Для синтеза витаминов В1, В2, В6, В12 и аскорбиновой кислоты также используют кефирные грибки, а бифидобактерии – группы В, РР (никотиновая кислота) и Н, однако пока эти микроорганизмы не используются как продуценты витаминов в промышленных масштабах.
Изменяя условия среды, содержание отдельных витаминов можно увеличить. Так, количество рибофлавина зависит от интенсивности аэрации и содержания железа в среде. Количество витаминов в клетках, а также их выделение из последних можно изменить при помощи микроэлементов. Существует производство рибофлавина на основе использования дрожжеподобных грибов Eremothecium ashbyii и Ashbia gossypii. Рибофлавин продуцируется также видами Clostridium и Ascomycetes. Микроводоросль Dunalieiia viridis культивируется с целью получения β-каротина.
Весьма перспективно использование грибных культур в качестве продуцентов сырных, грибных, рыбных ароматизаторов. Освоены биотехнологические способы получения веществ, имитирующих ароматы земляники, малины, банана, кокоса, яблока, персика, миндаля.
Микроорганизмы являются важным источником получения полимерных материалов на основе полисахаридов. Ценным микробным полисахаридом является декстран, образуемый бактериями рода Leucomonstoс. Декстран служит основой получения медицинских препаратов (кровезаменителей) и препаратов для биохимических исследований - сефадексов и др. молекулярных сит. Нуклеозиды, нуклеотиды и их производные также можно получать с помощью микроорганизмов.
Большинство пищевых красителей синтезируют химическим путем, но некоторые натуральные пигменты микроорганизмов могут быть с успехом использованы в качестве красителей для пищевых продуктов. Так, из гриба Monascus получен натуральный красный пищевой краситель. Из бактерий с Канарских островов получен розовый краситель для мороженого, крема, мыла. Такие красители безвредны и придают стойкий цвет продуктам, что позволяет предположить, что в будущем микробиологическому производству красителей будет уделяться больше внимания, чем в настоящее время.
В) В качестве пищевых красителей применяют как природные, так и синтетические вещества.
Натуральные (природные) красители- это красящие вещества, выделенные из природных источников (растительных или животных).
Близки к натуральным красителям их синтетические аналоги (идентичные натуральным), а так же природные соединения, подвергнутые химической модификации для улучшения их технологических и потребительских свойств.
Иногда пищевые красители получают из природных источников, обычно не используемых в качестве пищи, например краситель кошениль- из насекомых, обитающих на некоторых видах кактусов.
Натуральные пищевые красители чувствительны к воздействию кислот и щелочей, кислорода и температур.
Синтетические пищевые красители менее чувствительны к условиям технологической переработки и хранения, и дают яркие, легко воспроизводимые цвета.
Выбор и дозировка пищевых красителей для конкретного пищевого производства зависят от желаемого цвета и требуемой интенсивности окраски, а так же от физико-химических свойств готового продукта.
Стабилизаторы консистенции - вид пищевых добавок, получение которых методами биотехнологии развивается наиболее быстро в последние годы. Так, например, гелеобразователь Курдлан получают сбраживанием виноградного сахара с помощью Alkaligenes fekalis, модифицированные глюканы производят из Saccharomyces cerevisiae, каппа- каррагинан - из водорослей Euchema cottonii, глицерин - из глюкозы под действием Rhizopus javanicus, пуллулан - из мелассы с помощью Aureobasidium pullulans. Большинство пищевых красителей синтезируют химическим путем. Однако некоторые натуральные пигменты микроорганизмов могут быть с успехом использованы в качестве красителей для пищевых продуктов. Так, из гриба Monascus получен натуральный красный пищевой краситель, стойкость которого во много раз выше, чем у -дицианов (красителей из сине-зеленых водорослей).
Из микроорганизмов Flavobacterium multivorum получен каротиноид зеаксантин, из бактерий с Канарских островов - розовый краситель для мороженого, крема, мыла. Такие красители безвредны и придают стойкий цвет продуктам, что позволяет предположить, что в будущем микробиологическому производству красителей будет уделяться больше внимания, чем в настоящее время.
Вещества, способствующие продлению сроков хранения продукции, получают в больших количествах химическим путем. Однако имеется немало разработок по получению пищевых консервантов микробным синтезом.
Методами биотехнологии и генной инженерии можно получить ферменты, бактериальные пептиды и бактериоцины, обладающие свойствами консервантов.
Так, выделены хитиназы, разрушающие хитин в стенках клеток плесеней, глюканазы, гидролизующие крахмал в дрожжах и плесенях, бактериоцины из молочнокислых микроорганизмов, уничтожающие патогенную микрофлору. Однако перечисленные натуральные консерванты пока дороже искусственных аналогов, имеют сложную природу и взаимодействуют со многими компонентами, что пока недостаточно изучено. Все это сдерживает развитие биотехнологических способов получения
консервантов.
Производство консервантов с помощью микроорганизмов
С помощью микроорганизмов можно готовить различные консерванты, улучшающие качество кормов. Ценным питательным кормом для сельскохозяйственных животных является силос из богатых белком бобовых трав, злаково-бобовых смесей и крестоцветных культур. Но влажная зеленая масса из них силосуется с трудом, такой силос теряет много протеина. Заметно снижает потери новый консервант, предложенный одной из французских фирм. В его состав ученые включили молочнокислые бактерии, а также ферменты, разлагающие целлюлозу. Интенсивно развиваясь в силосуемой массе, бактерии быстро накапливают в ней молочную кислоту и тем самым сдерживают нежелательные процессы маслянокислого и уксуснокислого брожения. А содержащиеся в консерванте ферменты в свою очередь расщепляют сложные углеводы растительных частиц до простых сахаров - питательной среды для молочнокислых бактерий. Чтобы ускорить их развитие в начале силосования, в консервант включают крахмалистые добавки. Для этих же целей перед внесением в силосуемую массу препарат смешивают с богатой крахмалом мукой. На тонну измельченной зеленой массы расходуют от 7,5 до 30 кг обогащенного добавками консерванта. Затраты на него окупаются. Силос хорошо поедается молочным и мясным скотом, лучше переваривается и усваивается. В результате животным требуется меньше концентратов.
Г)Одно из нетрадиционных, появившихся не так давно направлений пищевой биотехнологии, - это получение и применение пробиотиков, пребиотиков и их комплексов - синбиотиков. Примерами тому могут служить разработки по получению пребиотиков: 1-кестозы (с помощью S. brevicaulis), лактосахарозы (с применением Arthrobacter sp.), фруктоолигосахаридов (из сахарозы под действием фруктозилтранс-феразы, извлеченной из Aspergillus niger). Пробиотики - это собственно микроорганизмы, преимущественно родов Lactobacillus и Bifidobacterium, обладающие широким спектром положительного воздействия на организм человека.
К функциональным соединениям, оказывающим позитивное влияние на здоровье человека, способствующим профилактике многих заболеваний, относятся полиненасыщенные жирные кислоты. Многие из них можно получить методами биотехнологии: арахидоновую кислоту - из грибов рода Mortierella, - линолевую - Mucorales и Mortierella, эйкозапентаеновую, докозапентаеновую, докозагексаеновую - из грибов порядка Thraustochytriales и Schizochytrium, а также из микроводорослей Cryptecodinium cohnii.
Ферменты можно получить только биотехнологическими методами. Особенно много разработок посвящено получению липазы (Propionibacterium acidipropionici, Rhizopus orysae), глюкоамилазы, глюкооксидазы и -фруктофуранозидазы (Aspergillus niger), полигалактуроназы и инвертазы (Endomycopsis fibuliger), протеиназы (Bacillus, Rhizopus, Aspergillus). Таким образом, анализ реферативных журналов показал, что к наиболее перспективным направлениям развития пищевой биотехнологии относятся следующие: получение ферментов, стабилизаторов консистенции, ароматизаторов, пищевых кислот, а также совершенствование технологии пробиотиков и пребиотиков.
ЛЕКЦИЯ 8
А) Биоремедиация — комплекс методов очистки вод, грунтов и атмосферы с использованием метаболического потенциала биологических объектов — растений, грибов, насекомых, червей и других организмов.
Биоремедиация in situ.
Биоремедиация in situ основана на очистке среды от поллютанта без удаления загрязнённой почвы из района загрязнения. Поскольку технологии этого типа не требуют проведения землеройных работ, они являются более дешёвыми, создают меньше запыления воздуха и высвобождают меньше летучих поллютантов, чем технологии ex situ.
Один из подходов биоремедиации in situ заключается во введении в загрязнённую почву кислорода с помощью специального оборудования, с тем, чтобы стимулировать рост микроорганизмов и аэробную биодеградацию поллютантов. Данная техника чаще всего применяется для очистки от различных нефтепродуктов.
Помимо кислорода стимуляция биодеградации может осуществляться путём введение в почву питательных веществ для стимуляции роста и метаболизма микроорганизмов, осуществляющих деградацию поллютанта. Чаще всего для этих целей используют азот- и фосфорсодержащие удобрения.
Другим распространённым подходом является введение в почву микроорганизмов (в том числе генетически модифицированных) или ферментов для ускорения деградации органических поллютантов, присутствующих в почве.
Биоремедиация ex situ.
Биоремедиация ex situ основана на снятие слоя загрязнённой почвы и очистке её от поллютантов за пределами места загрязнения, что делает этот подход более дорогостоящим, чем биоремедиация in situ. Тем не менее, у технологий данного типа есть ряд преимуществ: они требуют меньше времени и обеспечивают полный контроль процесса очистки.
Одним из типов применяемых при биоремедиация in situ технологий является использование биореакторов. Перед помещением в биореактор из почвы удаляются крупные камни, грунт подвергается перемешиванию, что делает его более однородным; после добавления воды образуется глинистая суспензия. В данную суспензию вносятся проводящие очистку от поллютанта почвы микроорганизмы, для которых в реакторе создаются оптимальные условия. После завершения процесса очистки почва высушивается и возвращается в окружающую среду.
Другой подход биоремедиации in situ заключается в том, что удалённая с места загрязнения почва размещается на определённой территории, её обеспечивают аэрацией, питательными веществами и водой для стимуляции роста и метаболизма микроорганизмов, осуществляющих биоремедиацию. По сравнению с очисткой с помощью биореакторов, данная технология требует много места и занимает дольше времени. Можно выделить несколько различных вариантов такого подхода.
В одном из вариантов загрязнённую почву удаляют с места загрязнения и распределяют тонким слоем на площади, специально огороженной по периметру для предотвращения распространения загрязнения за её пределы. Почву вспахивают для обеспечения доступа кислорода почвенным микроорганизмам и добавляют стимулирующие их рост вещества. Также над почвой разбрызгивают воду, что позволяет поддерживать оптимальную влажность и понижает запыленность воздуха.
Загрязнённую почву можно также складывать толстым слоем высотой 1-3 метра. При этом аэрация путём вспахивания заменяется аэрацией с помощью системы труб, доставляющих в почву воздух для стимуляции биодеградации. В данном случае почву обычно смешивают с каким-нибудь рыхлым веществом (например, соломой), чтобы облегчить аэрацию. В процессе ремедиации из-за продувки воздуха происходит испарение из грунта различных веществ, в том числе самого поллютанта, поэтому система обязательно снабжается датчиком состава почвенных испарений. Также в грунт добавляют удобрения и поддерживают на определённом уровне влажность.
При смешивании грунта с большим количеством разрыхлителей (сена, кукурузных кочерыжек, соломы) аэрацию можно осуществлять с помощью вакуумных насосов или вентиляторов. Такую смесь также можно аэрировать путём перемешивания в специальных резервуарах. Ещё один вариант – размещение загрязнённой почвы с разрыхлителем в длинные кучи, регулярно перемешиваемые тракторами. Во всех этих трёх случаях соотношение разрыхлитель/почва составляет примерно 1/3. После каждого перемешивания почва укрывается, что позволяет поддерживать нужную температуру и влажность. Очистка таким способом занимает недели вместо обычных для биоремедиации почв месяцев.
Другие улучшенные методы биоремедиации
Существует целый ряд методов биоремедиации, позволяющих проводить более полную очистку почвы, причём как в условиях in situ так и ex situ.
Одной из таких перспективных технологий является применение пены.
Смесь пенообразующего вещества вместе с деградирующими бактериями накачивается сжатым воздухом на определённой глубине почвы. Пена мобилизирует загрязняющие вещества (в частности жидкие углеводороды) и повышает их биодоступность. С помощью вакуумного насоса смесь пены, бактерий и деградируемого поллютанта выкачивается из почвы, поллютант удаляется на дальнейшую деградацию, а очищенное пенообразующее вещество снова используют вместе с микроорганизмами для очистки.
Другая перспективная технология биоремедиации почвы основана на механизме электролиза.
В почву помещают две противоположно электрически заряженных конструкции (по сути, катод и анод). Происходит электролиз почвенной воды, образуется водород и стимулирующий метаболизм деструкторов кислород. Кроме стимуляции кислородом, рост и метаболизм микроорганизмов стимулируется повышением температуры, сопровождающим электролиз. Водород и кислород, а также другие выделяющиеся из почвы газообразные вещества, затем собирают в танкер. После смешивания в танкере они обратно накачиваются в почву. Также в почву поставляется вода и лактат для обеспечения оптимальной влажности и рН.
Б) Фиторемедиация — комплекс методов очистки вод, грунтов и атмосферного воздуха с использованием зеленых растений.
Технологии фиторемедиации.
Растения и ризосферные микроорганизмы в процессе фиторемедиации могут использоваться различными путями.
Растения могут применяться как фильтры в созданных искусственно заболоченных участках или в промышленных установках. К данным технологиям в частности относится ризофильтрация - использование растений в гидропонных установках для фильтрации загрязнённой воды. Для фиторемедиации в искусственно созданных заболоченных территориях применяются различные водные виды: ряска (Lemna sp.) и (Azolla sp.) – для неорганических поллютантов (хорошие накопители металлов и лёгкий сбор биомассы), виды родов Myriophyllum и Elodea - для органических поллютантов (высокий уровень деградирующих ферментов). В процессе ризофильтрации осуществляется интенсивное аэрирование, что позволяет использовать также наземные растения (часто используются горчица Brassica juncea и подсолнечник Helianthus annuus). Искусственно созданные заболоченные территории применяются для очистки от широкого круга неорганических (металлы, цианиды, нитраты, фосфаты) и некоторых органических (гербициды, взрывчатые вещества) поллютантов. Ризофильтрация по причине своей дороговизны пригодна для очистки небольших количеств сточных вод содержащих опасные неорганические поллютанты, такие как радионуклиды.
Древесные виды растений могут использоваться в фиторемедиации в качестве барьера для воды, чтобы создать восходящий ток воды в корневую зону, препятствуя утечке загрязнения вглубь, и препятствовать горизонтальному распространению загрязнённых грунтовых вод. Для этого применяются виды с хорошо развитой корневой системой и высоким уровнем транспирации (например, тополь).
Другая технология, называемая фитоэкстракцией, заключается в использовании растений для экстрагирования поллютантов и аккумулирования их в тканях, после чего надземная растительная биомасса собирается. Растительный материал может далее либо использоваться для непищевых целей (производство дерева, картона) либо сжигаться с последующим вывозом золы на свалку или, в случае ценных металлов, рециркуляцией накопленных элементов. Данная технология главным образом используется для очистки от неорганических поллютантов (металлы, селен, мышьяк, радионуклиды). Для фитоэкстракции часто применяют горчицу Brassica juncea и подсолнечник Helianthus annuus из-за их быстрого роста, большой биомассы и высокой устойчивости к неорганическим поллютантам. Также обнаружены ряд растений-гипераккумуляторов, способных накапливать один или несколько элементов (некоторые металлы, As, Se) до уровня в два порядка выше, чем другие виды (до 0,1-1% сухой биомассы). Так, растение, гипераккумулирующее никель, Alyssum bertolonii, уже применялось в полевых условиях для фитоэкстракции.
Технология фитостимуляции состоит в применении растений для стимуляции биодеградации поллютантов микробами в ризосфере. Такая стимуляция биодеградации осуществляется за счёт секреции растениями органических веществ, используемых ризосферными микроорганизмами в качестве источника энергии и углерода, а также различных вторичных метаболитов, активирующих гены, ответственные за синтез деградирующих ферментов. Для фитостимуляции микробов-деструкторов корневой зоны применяются растения обладающие обширной плотной корневой системы и секретируюшие специфические вещества, способствующие росту микробов. В частности используются различные травы (например, овсянница Festuca sp., плевел Lolium sp.) из-за их обширной и плотной корневой системы и шелковица (тутовое дерево) из-за секреции фенольных соединений - индукторов генов микроорганизмов вовлечённых в разрушение циклических углеводородов. Фитостимуляция применяется для очистки от гидрофобных органических поллютантов (ПХБ, углеводороды нефтепродуктов), которые не могут быть поглощены растениями, но могут быть деградированы микробами.
Также растения могут напрямую деградировать органические поллютанты с помощью своих ферментов, обычно внутри тканей, до неорганических соединений или до стабильных интермедиатов, накапливающихся в растении. Технология использования растений для деградации поллютантов получила название фитодеградация. она эффективна против органических поллютантов обладающих хорошей подвижностью в растении (гербициды, ТНТ, трихлорэтилен). Применяемые для фитодеградации виды характеризуются наличием обширной плотной корневой системы и высоким уровнем синтеза ферментов деградации (наиболее часто применяют растения тополя).
Технология, получившая название фитоиспарение, основывается на том, что после поглощения некоторые поллютанты могут покидать растение в летучей малотоксичной форме. Например, неорганический селен ассимилируется растением в форме селеноаминокислот – селеноцистеина и селенометионина. Последний может метилироваться с образованием летучего диметилселенида на 2-3 порядка менее токсичного, чем неорганический селен. Если летучее соединение всё же токсично, то после испарения растением оно разбавляется в атмосфере до уровня не представляющего угрозы. Фитоиспарение может быть использована для летучих органических соединений (трихлорэтилен) и некоторых неорганических веществ, способных переводиться растением в летучее состояние (селен, ртуть). Обычно в данной технологии применяют всё тот же тополь благодаря высокому уровню транспирации; в очистке от селена эффективны виды рода Brassica, рис.
Так как процессы, вовлечённые в фиторемедиацию, происходят в естественных условиях, покрытые растительностью загрязнённые районы склонны к самоочищению без человеческого вмешательства. Такое самоочищение является простейшей формой фиторемедиации и включает в себя только мониторинг; пригодно для использования в удалённых районах с неинтенсивной человеческой деятельностью и низким уровнем загрязнения.
Необходимо отметить, что, не смотря на эффективность фиторемедиации, во многих случаях лежащие в основе этого процесса биологические механизмы остаются неизвестными. Чтобы повысить эффективность технологий фиторемедиации проводятся интенсивные исследования вовлечённых биологических процессов (взаимодействия растение-микроорганизм, механизмы деградации органических поллютантов, механизмы транспорта и хелатирования неорганических поллютантов).
Биодеградация (биологический распад, биоразложение) — разрушение сложных веществ, материалов, продуктов в результате деятельности живых организмов; чаще всего при упоминании биодеградации подразумевается действие микроорганизмов, грибов, водорослей. Однако, в строгом смысле, размерами биологических организмов термин не определяется.
Рассмотрим процессы биодеградации сложных смесей углеводородов и их производных в средах, загрязненных нефтью. Речь пойдет как о сточных водах нефтяной промышленности, так и о загрязнении нефтью окружающей среды. Источники таких загрязнений могут быть самые разнообразные: промывка корабельных бункеров для горючего, аварии на танкерах в открытом море (основная причина нефтяных загрязнений окружающей среды), утечки в нефтехранилищах и сброс отработанных нефтепродуктов.
Сточные воды нефтяной промышленности обычно очищают биологическим способом после удаления большей части нефти физическими способами или с помощью коагулянтов. Токсическое воздействие компонентов таких сточных вод на системы активного ила можно свести к минимуму путем постепенной «акклиматизации» очистной системы к повышенной скорости поступления стоков и последующего поддержания скорости потока и его состава на одном уровне. Однако загрузка этих систем может значительно варьировать и, видимо, лучше использовать более совершенные технологии, например системы с илом, аэрированным чистым кислородом, или же колонные биореакторы.
Самые большие утечки нефти в окружающую среду происходят в море, где она затем подвергается различным физическим превращениям, известным как выветривание. В ходе этих абиотических процессов, включающих растворение, испарение и фотоокисление, разлагается ( в зависимости от качества нефти и от метеорологических условий) 25 - 40% нефти. На этой стадии разрушаются многие низкомолекулярные алканы. Степень микробиологической деградации выветрившихся нефтяных разливов определяется рядом факторов. Весьма важен состав нефти: относительное содержание насыщенных, ароматических, содержащих азот, серу и кислород соединений, а также асфальтенов в различных типах нефти различно. Определенную устойчивость нефти придают разветвленные алканы, серосодержащие ароматические соединения и асфальтены. Кроме того, скорость роста бактерий, а, следовательно, и скорость биодеградации определяются доступностью питательных веществ, в частности азота и фосфора. Оказалось, что добавление таких веществ увеличивает скорость биодеградации. Количество разных организмов, способных расти на компонентах нефти, зависит от степени загрязненности углеводородами. Например, больше всего их находят поблизости от крупных портов или нефтяных платформ, где среда постоянно загрязнена нефтью. Полная деградация нефти зачастую не происходит даже при участии богатых по видовому составу микробных сообществ. Наиболее биологически инертные компоненты, например асфальтены, содержатся в осадочных породах и нефтяных залежах. Основные физические факторы, влияющие на скорость разложения нефти, - это температура, концентрация кислорода, гидростатическое давление и степень дисперсности нефти. Наиболее эффективная биодеградация осуществляется тогда, когда нефть эмульгирована в воде.
Особую проблему представляют выбросы или случайные разливы нефти на поверхности почвы, поскольку они могут привести к загрязнению почвенных вод и источников питьевой воды. В почве содержится очень много микроорганизмов, способных разрушать углеводороды. Однако даже их активность не всегда достаточна, если образуются растворимые производные или поверхностно-активные соединения, увеличивающие распространение остаточной нефти.
Для ликвидации нефтяных разливов на водных поверхностях используются методы сбора нефти с последующим ее разделением, буксировка нефтяных пятен, обработанных отвердителем, применение адсорбирующих веществ (солома, торф, ленты из полипропилена и др.). Один из методов - это сбор нефти с использованием акустических излучателей. Применяется обработка нефти адсорбентами и абсорбентами (песок, донные отложения с добавкой кремнезема или мела, лигниновая и тальковая пыль).
Однако, применяемые физико-химические методы восстановления почв и вод, нередко сами по себе наносят больший экологический ущерб природе, чем нефтяное загрязнение. При таких методах очистки почв может происходить необратимое уничтожение плодородного слоя сельскохозяйственных угодий, загрязнение дополнительных поверхностей почв при вывозе и складировании нефтезагрязненного слоя. Диспергенты, применяемые для ликвидации нефтяных разливов, оказывают токсическое воздействие на морские организмы, извлекая кислород из воды, создают мертвые зоны при штиле.
Наиболее перспективным методом очистки почв и акваторий от загрязнений нефтью и нефтепродуктами признан биологический метод. Основным преимуществом этого метода является использование природных углеводородутилизирующих микроорганизмов.
В настоящее время существует 3 основных направления биологической очистки почв: биообработка твердой фазы, заключающаяся в обеспечении оптимальных условий для развития собственной почвенной микрофлоры, биообработка в реакторах, предусматривающих обработку почвы в виде пульпы в биореакторе, в котором обеспечивается за счет перемешивания контакт микроорганизмов с водо-нерастворимыми загрязнителями и создаются условия для осуществления процесса микробной деградации и биообработка in situ, основанная на внесении в почву микроорганизмов - деструкторов загрязнений.
При наличии больших площадей загрязненных почв, эффективно проводить обработку биодеструкторами, при этом отсутствует необходимость в транспортировке загрязненных почв. Внесение в загрязненную почву чистых культур, способных осуществлять окисление алифатических, ароматических и других углеводородов приводит, как правило, к ускорению очистки почвы и позволяет обеспечить стабильность процесса биологического распада при относительно невысокой стоимости очистки. Спектр используемых микроорганизмов для деструкции углеводородов нефти в почве включает в себя бактерии родов Pseudomonas, Flavobacterium, Acinetobacter, Aeromonas, Arthrobacter, Rhodococcus, дрожжи рода Candida, микромицеты Fusarium, Mucor, Trichoderma, Rhizopus, Penicillium. Эффект от внесения в почву микроорганизмов наблюдается в случае обеспечения благоприятных условий для их жизнедеятельности (t, pH, окислительно-восстановительные условия, доступные источники азота, фосфора и магния). Применяемые культуры должны быть безвредны не только для человека и животных, но и для почвенной биоты, насекомых.
В местах сильного загрязнения окружающей среды (более 20% загрязнения) эффективно применять не один метод, а их комплекс. Использование микроорганизмов целесообразно при низких концентрациях загрязнения либо на заключительных стадиях очистки после применения других способов, главным образом, механических.
Основным преимуществом биотехнологий очистки нефтезагрязненных почв и вод является использование природных углеводородутилизирующих микроорганизмов. Это делает их более экологически безопасными по сравнению с механическими и физико-химическими методами удаления нефтяных загрязнений, так как подразумевает использование микроорганизмов, изначально выделенных из образцов почв и вод, загрязненных нефтью и нефтепродуктами. Вводимые в загрязненные экосистемы микроорганизмы, как правило, не являются для нее чужеродным агентом, что происходит при использовании различных химических способов очистки (адсорбенты, диспергенты). Так, микроорганизмы, используемые для ликвидации нефтяных разливов в море, в свою очередь являются пищей для планктона и других морских организмов, обеспечивая тем самым определенные трофические связи. Кроме того, использование для очистки вод наземных форм микроорганизмов, будет приводить к их гибели после утилизации всей имеющейся нефти, что обуславливает ненужность дополнительных операций очистки после окончания процесса микробной деградации нефтяного загрязнения.
Условия, необходимые для деградации нефти микроорганизмами определил еще Таусон в 1928 г:
наличие воды и минеральных солей,
наличие источников азота и фосфора,
присутствие свободного кислорода,
нейтральное значение рН.
Все эти критерии обязательно используются при разработке биотехнологий. Кроме того, для успешного применения биотехнологий необходимо предварительное решение следующих задач:
определение химической природы загрязнителя,
количественная оценка загрязнителя (количественное значение углеводородной фракции),
растворимость загрязнения,
биодеградабельность загрязнения,
почвенная проницаемость (в почвах с низкой проницаемостью биодеградация происходит с чрезвычайно низкой скоростью).
Различные группы и даже виды углеводородокисляющих микроорганизмов сильно различаются по способности усваивать углеводороды различных классов, развиваться в аэробных и в микроаэробных или в анаэробных условиях, в нейтральных, кислых и щелочных средах.
Наиболее легко микроорганизмами разрушаются нормальные парафины. Труднее разрушаются углеводороды с разветвленными углеродными цепями и, тем трудней, чем ближе расположены замещающие группы. Наиболее трудно разрушаются нафтены и циклопарафины. К самым устойчивым можно отнести декалин и циклогексан.
Использование в качестве биодеградантов микробных консорциумов (смешанная культура нескольких штаммов микроорганизмов) со сложными ассоциативными связями наиболее эффективно для очистки почвы и вод в короткие сроки. Потенциал смешанной культуры микроорганизмов не является результатом простого суммирования свойств отдельных штаммов, входящих в ассоциацию. Использование в качестве бактериального препарата монокультуры, даже использующей широкий крут углеводородов нефти в лабораторных условиях менее эффективно, чем препаратов из смешанных культур.
В настоящее время в России разработано около 40 биопрепаратов на основе нефтеокисляющих бактерий, актиномицетов и микроскопических грибов.
Одной из наиболее важных характеристик биопрепаратов является максимальный уровень загрязнения, подлежащий устранению. Многие из известных препаратов эффективны лишь при низком уровне загрязнения нефтью и нефтепродуктами, что существенно ограничивает их применение. Наиболее перспективными являются препараты, которые эффективны при уровне загрязнения от 5% и выше (до 20 %). К таким препаратам относятся дизойл, деворойл, родер, нафтокс, дестройл, ленойл, руден, путидойл, экоил, микрозим петротрит.
Важным показателем биопрепаратов является вид препаративной формы. Этот показатель определяет срок хранения препарата. Препараты биодеграданты нефти могут использоваться в виде следующих препаративных форм: культуральной жидкости; пасты; культуральной жидкости на твердых носителях; в виде сухой формы. Препараты в сухой форме имеют перед остальными такое преимущество, как более длительный срок хранения, что особенно важно в условиях большого числа аварийных ситуаций, связанных с добычей и переработкой нефти.
Таким образом, главная роль в превращении углеводородов нефти и нефтепродуктов в почве и в воде принадлежит микроорганизмам, и чем больше их численность и разнообразие, тем значительнее их вклад в поддержание динамического равновесия в биосфере.
В) БИОТОПЛИВО — топливо из биологического сырья, получаемое, как правило, в результате переработки биологических отходов. Существуют также проекты разной степени проработанности, направленные на получение биотоплива из целлюлозы и различного типа органических отходов, но эти технологии находятся в ранней стадии разработки или коммерциализации. Различается жидкое биотопливо (для двигателей внутреннего сгорания, например, этанол, метанол, биодизель), твёрдое биотопливо (дрова, брикеты, топливные гранулы, щепа, солома, лузга) и газообразное (биогаз, водород).
БИОЭТАНОЛ — обычный этанол, получаемый в процессе переработки растительного сырья для использования в качестве биотоплива.
В настоящее время большая часть биоэтанола производится из кукурузы (США) и сахарного тростника (Бразилия). Сырьём для производства биоэтанола также могут быть различные с/х культуры с большим содержанием крахмала или сахара: маниок, картофель, сахарная свекла, батат, сорго, ячмень и т. д.
Методы производства биоэтанола
Брожение
Известный с давних времён способ получения этанола — спиртовое брожение органических продуктов, содержащих углеводы(виноград, плоды и т. п.) под действием ферментов дрожжей и бактерий.
В результате брожения получается раствор, содержащий не более 15 % этанола, так как в более концентрированных растворахдрожжи обычно гибнут. Полученный таким образом этанол нуждается в очистке и концентрировании, обычно путем дистилляции.
Промышленное производство спирта из биологического сырья
Современная промышленная технология получения спирта этилового из пищевого сырья включает следующие стадии:
подготовка и измельчение крахмалистого сырья — зерна (прежде всего — ржи, пшеницы), картофеля, кукурузы и т. п.
ферментация. На подавляющем большинстве спиртовых производств мира ферментативное расщепление крахмала до спирта при помощи дрожжей оставлено. Для этих целей применяются рекомбинантные препараты альфа-амилазы, полученные биоинженерным путем — глюкамилаза, амилосубтилин.
брагоректификация. Осуществляется на разгонных колоннах (например, «Комсомолец»).
Гидролизное производство
В промышленных масштабах этиловый спирт получают из сырья, содержащего целлюлозу (древесина, солома), которую предварительно гидролизуют. Образовавшуюся при этом смесь пентоз и гексоз подвергают спиртовому брожению. В странахЗападной Европы и Америки эта технология не получила распространения, но в СССР (ныне в России) существовала развитая промышленность кормовых гидролизных дрожжей и гидролизного этанола.
Этанол является менее «энергоплотным» источником энергии чем бензин (это касается только смесей с высоким содержанием этанола); пробег машин работающих на Е85 (смесь 85 % этанола и 15 % бензина; буква «Е» от английского Ethanol) на единицу объёма топлива составляет примерно 75 % от пробега стандартных машин. Обычные автомобильные ДВС не могут работать на Е85, хотя прекрасно работают на Е10(некоторые утверждают что можно использовать даже Е15 и успешно используется Е40 (А95-Е)). На «настоящем» этаноле могут работать только т. н. машины «Flex-Fuel» (автомобиль с многотопливным двигателем). Эти автомобили также могут работать на обычном бензине (небольшая добавка этанола всё же требуется) или на произвольной смеси того и другого. Бразилия является лидером в производстве и использовании биоэтанола из сахарного тростника в качестве топлива.
БИОДИЗЕЛЬ — биотопливо на основе растительных или животных жиров (масел), а также продуктов их этерификации.
Растительное масло переэтерифицируется метанолом, реже этанолом или изопропиловым спиртом (приблизительно в пропорции на 1 т масла 200 кг метанола + гидроксид калия или натрия) при температуре 60°С и нормальном давлении.
Для получения качественного продукта необходимо выдержать ряд требований:
После прохождения реакции переэтерификации содержание метиловых эфиров должно быть выше 96 %.
Для быстрой и полной переэтерификации метанол берется с избытком, поэтому метиловые эфиры необходимо очистить от него.
Использовать метиловые эфиры в качестве топлива для дизельной техники без предварительной очистки от продуктов омыления недопустимо. Мыло засорит фильтр и образует нагар, смолы в камере сгорания. При этом сепарации и центрифугирования недостаточно. Для очистки необходима вода или сорбент.
Заключительный этап — сушка метиловых эфиров жирных кислот. Так как вода приводит к развитию микроорганизмов в биодизеле и способствует образованию свободных жирных кислот, вызывающих коррозию металлических деталей.
Хранить биодизель более 3 месяцев не рекомендуется — разлагается.
При производстве биодизеля в результате реакции этерификации получается смесь, которой дают отстояться. Легкие верхние фракции продукта и являются рапсовым метил-эфиром, или биодизельным топливом. Нижние фракции являются так называемойглицериновой фазой, которую часто неправильно называют глицерином. На самом деле до чистого глицерина её ещё нужно «довести», без чего её хранение и утилизация представляют серьёзную проблему из-за повышенной щелочности и содержанияметанола. Те же проблемы возникают при использовании для этерификации этанола. Впрочем, биодизель на этаноле производить менее выгодно из-за большей плотности.
Наиболее перспективным источником сырья для производства биодизеля являются водоросли. По оценкам Департамента Энергетики США с одного акра(4047м² ~ 0,4га) земли можно получить 255 литров соевого масла, или 2400 литровпальмового масла. С такой же площади водной поверхности можно производить до 3570 барреля бионефти (1 баррель = 159 литров).
Кроме выращивания водорослей в открытых прудах существуют технологии выращивания водорослей в малых биореакторах, расположенных вблизи электростанций. Сбросное тепло ТЭЦ способно покрыть до 77 % потребностей в тепле, необходимом для выращивания водорослей. Эта технология не требует жаркого пустынного климата.
Г)БИОГАЗ — газ, получаемый водородным или метановым брожениембиомассы. Метановое разложение биомассы происходит под воздействием трёх видов бактерий. В цепочке питания последующие бактерии питаются продуктами жизнедеятельности предыдущих. Первый вид — бактерии гидролизные, второй — кислотообразующие, третий — метанообразующие. В производстве биогаза участвуют не только бактерии класса метаногенов, а все три вида. Одной из разновидностей биогаза является биоводород, где конечным продуктом жизнедеятельности бактерий является не метан, а водород.
Перечень органических отходов, пригодных для производства биогаза: навоз, птичий помёт, зерновая и мелассная послеспиртовая барда, пивная дробина, свекольный жом, фекальные осадки и т.д.
Выход биогаза зависит от содержания сухого вещества и вида используемого сырья. Из тонны навоза крупного рогатого скота получается 50—65 м³ биогаза с содержанием метана 60 %, 150—500 м³ биогаза из различных видов растений с содержанием метана до 70 %. Максимальное количество биогаза — это 1300 м³ с содержанием метана до 87 % — можно получить из жира.
Производство биогаза позволяет предотвратить выбросы метана в атмосферу. Метан оказывает влияние на парниковый эффект в 21 раз более сильное, чем СО2, и находится в атмосфере 12 лет. Захват метана — лучший краткосрочный способ предотвращения глобального потепления.
Переработанный навоз, барда и другие отходы применяются в качестве удобрения в сельском хозяйстве. Это позволяет снизить применение химических удобрений, сокращается нагрузка на грунтовые воды.