Тема 25 лабораторная диагностика сибирской язвы. Биопрепараты

Цель занятия. Ознакомить студентов со свойствами возбудите­ля, схемой лабораторной диагностики сибирской язвы, биопре­паратами.

Оборудование и материалы. Культура вакцинного штамма В. anthracis на МПА, в МПБ, мазки с феноменом «ожерелья», си­биреязвенная преципитирующая сыворотка, стандартный анти­ген, пробирки Уленгута, штативы, пипетки Пастера, сибиреяз­венные биопрепараты.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Сибирская язва. Острое инфекционное заболевание сельско­хозяйственных животных многих видов, а также человека; харак­теризуется признаками септицемии или образованием карбунку­лов, у свиней часто протекает с поражением заглоточных лимфа­тических узлов.

Возбудитель сибирской язвы — бактерия Bacillus anthracis, род Bacillus.

Лабораторная диагностика сибирской язвы основана на резуль­татах бактериологического исследования.

Бактериологическое исследование вклю­чает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале (ме­тодом световой и люминесцентной микроскопии, а также био­пробой), выделение чистой культуры и идентификацию возбуди­теля по культурально-морфологическим признакам. При нечет­ких результатах применяют и другие методы.

Материал для исследования. В лабораторию направляют ухо от трупа животного, перевязанное у основания (ухо отрезают с той стороны, на которой лежит труп), или кровь из надреза уха в виде толстого мазка на двух предметных стеклах (чтобы исклю­чить попадание возбудителя во внешнюю среду, место разреза прижигают шпателем); от трупов свиней -заглоточные лимфа­тические узлы и участки отечной соединительной ткани. Если подозрение на сибирскую язву возникло в ходе вскрытия, его прекращают и на исследование направляют часть селезенки.

Нативный материал помещают в чистую посуду (пробирки, банки). Высушенные мазки кладут в чашки Петри, которые обо­рачивают плотной бумагой. На упаковке делают надпись «Мазок не фиксирован!» Посуду с материалом помещают во влагонепро­ницаемую тару, обвязывают, пломбируют или опечатывают, де­лают надпись «Верх. Осторожно!» и с сопроводительными доку­ментами нарочным направляют в лабораторию.

Микроскопия препаратов из исходного материала. Возбудитель представляет собой грамположительные прямые палочковидные бактерии размером (l...l,5) х (6...10) мкм, без жгутиков, образует спору и капсулу.

Из поступившего в лабораторию материала готовят мазки, ок­рашивают по Граму; одним из методов для выявления капсулы (методы Михина, Гимзы, Ольта и т. д.), а также сибиреязвенными люминесцирующими сыворотками. В окрашенных мазках из трупного материала возбудитель обнаруживают в виде крупных грамположительных палочковидных бактерий, располагающихся одиночно, парами, короткими цепочками. Концы палочек, обра­щенные друг к другу, резко обрублены,.свободные концы закруг­лены, клетки окружены капсулой. В отдельных случаях, особен­но в мазках из материала, полученного от свиней, форма клеток может быть нетипичной: короткие, толстые, изогнутые или зер­нистые палочки со вздутием в центре или на концевых частях бактерий.

Предварительный ответ в хозяйство, откуда поступил матери­ал, ддют немедленно по результатам микроскопического иссле­дования.

Выделение и идентификация культуры возбудителя. Факульта­тивный анаэроб, температурный оптимум 35...37 °С, рН 7,2...7,4. С целью выделения культуры возбудителя исследуемый материал засевают в МПБ, на МПА или в бульон и агар Хоттингера и ин­кубируют в аэробных условиях 18...24 ч, а при отсутствии роста — до 48 ч.

На МПА М. anthracis формирует плоские, матово-серые, ше­роховатые, с отростками на краях колонии (R-форма), может образовывать и атипичные коло­нии без отростков. Края коло­ний R-формы под малым увели­чением микроскопа имеют вид локонов, получивших название «львиная грива» (рис. 83). В МПБ рост возбудителя характе­ризуется образованием на дне пробирки рыхлого осадка при прозрачной питательной среде; после встряхивания осадок раз­бивается на хлопья. Если возбудитель выращивать на питательных средах, содержащих сыво­ротку крови, и в атмосфере с повышенным содержанием оксида углерода (IV), то на МПА образуются гладкие колонии S-формы, а в МПБ отмечают рост в виде диффузного помутнения среды.

Рис. 83. Колонии В. anthracis на агаре под малым увеличением. Образование локонов

В выросших культурах исследуют морфлогические и тинкто-риальные свойства клеток. В мазках, окрашенных по Граму, об­наруживают длинные цепочки из грамположительных типичных палочек; в мазках из культур на средах с диффузным ростом на­ходят отдельные или парные палочки (рис. 84...86). На бессыво­роточных средах бактерии капсулу не образуют, на сывороточ­ных средах возбудитель формирует капсулу, причем клетки в препарате в последнем случае чаще располагаются одиночно или парами.

При значительной контаминации материала посторонней микрофлорой (сырье животного происхождения, объекты внеш­ней среды) посев делают на се­лективный агар следующего состава: расплавленный МПА — 100 мл, сульфат полимиксина М —0,5 мл, невиграмон —0,5 мл, гризеофульвин — 1 мл, моющее средство «Прогресс» —10 мл, фенолфталеинфосфат натрия — 0,1 мл; перемешивают, разлива­ют по чашкам Петри. Через 18...24ч культивирования на внутрен­нюю поверхность крышки чашки Петри наносят 1...2мл 25%-го водного раствора аммиака, чашку переворачивают. Колонии В. anthracis остаются бесцветными, колонии бактерий с фосфатазной активностью розовеют.

Рис. 86. Клетки В. anthracis в крови животного:

1 — клетки возбудителя с капсулой; 2 — форменные элементы крови

Биопроба. Заражение лабораторных животных исходным мате­риалом — обязательный этап, проводимый сразу после поступле­ния материала в лабораторию. Тканевой суспензией заражают подкожно двух белых мышей по 0,2...0,5 мл или морских свинок по 0,5...2 мл. Наблюдение ведут в течение 10 сут. При наличии возбудителя животные погибают обычно через 1...3 cyт. Павших животных исследуют с выделением культуры возбудителя.

Если в ходе указанных исследований выделена бактерия, ти­пичная для В. anthracis по морфологическим, тинкториальным и культуральным свойствам, патогенная для лабораторных живот­ных, то дальнейшие исследования не проводят и диагноз счита­ют установленным.

В случае получения нечетких результатов при вышеизложен­ных исследованиях проводят дополнительные с целью диффе­ренциации выделенной культуры от сходных сапрофитных бацилл, и в первую очередь от В. cereus. При этом определяют спо­собность микроорганизма к капсулообразованию путем посева на сывороточные среды, патогенность для лабораторных живот­ных в биопробе, чувствительность к пенициллину, сибиреязвен­ному бактериофагу, специфичность к сибиреязвенным люминесцирующим сывороткам, гемолитическую активность, наличие жгутиков (табл. 22).

Тест «жемчужного ожерелья» разработан для определения чувствительности выделенного микроорганизма к пенициллину. В две колбочки (пробирки) с расплавленным МП А (температура 45...50°С) добавляют пенициллин из расчета 0,05...0,5 ЕД/мл и переносят в две чашки Петри, в третью чашку наливают обыч­ный МПА. После застывания агара из него вырезают пластинки размером 1,5 см², которые переносят на предметные стекла и по­мещают в чашки Петри. На каждую пластинку бактериологичес­кой петлей наносят исследуемую 3-часовую бульонную культуру. Чашки выдерживают 1...3 ч в термостате. Затем посевы просмат­ривают под микроскопом с объективом х 40 и иммерсионной си­стемой. Перед просмотром зону роста накрывают покровным стеклом. Сибиреязвенные микробы на МПА с пенициллином приобретают шаровидную форму, а цепочки — вид «жемчужного ожерелья». Спорообразующие сапрофитные аэробы в аналогич­ных условиях растут в обычной форме. На агаре без пенициллина сибиреязвенные микробы образуют длинные цепочки из типич­ных палочек.

Для определения чувствительности к сибиреязвенному бакте­риофагу культуру или материал засевают на скошенный МПА, за­тем на поверхность среды наносят каплю бактериофага в рабочем титре и посевы выдерживают при температуре 37...38°С 24 ч. В случае принадлежности культуры к В. anthracis на поверхности МПА в зоне нанесения бактериофага остается стерильная зона при наличии роста микроорганизма на остальных участках среды.

Для идентификации В. anthracis методом люминесцирующих антител используют флуоресцирующую адсорбированную сыво­ротку, не дающую перекрестных реакций с антигенно-родственными сапрофитными бациллами.

Гемолитическую активность исследуемой культуры определя­ют посевом на 5%-й МПА или в МПБ.

Наличие жгутиков исследуют посевом в 0,3%-й МПА или ме­тодом «раздавленной капли».

Если для исследования поступил загнивший материал, кото­рый нельзя подвергать бактериологическому исследо­ванию, то диагноз ставят на оснований обнаружения антигенов возбудителя в материале при помощи реакции кольцевой преци­питации.

Материал экстрагируют физиологическим раствором (соотно­шение 1:10) путем кипячения в течение 30...40 мин (горячий способ). Экстракцию смеси тканевой суспензии и карболизиро-ванного физиологического раствора (соотношение 1 : 10) можно проводить в течение 16... 18 ч при комнатной температуре (холод­ный способ). Экстракт фильтруют через асбестовую вату и иссле­дуют в РП.

Реакцию ставят методом «наслаивания» или «подслаивания». При «наслаивании» в преципитационную пробирку вносят 0,2...0,3 мл преципитирующей сыворотки и осторожно наливают (наслаивают) исследуемый экстракт таким образом, чтобы ком­поненты не перемешивались. При «подслаивании» в пробирку вначале вносят 0,2...0,3 мл экстракта, затем под него пастеровс­кой пипеткой — равное количество сибиреязвенной преципити­рующей сыворотки. Одновременно ставят контроли (см. далее). Реакцию считают положительной, если через 1...2 мин и не поз­же чем через 15 мин на границе между компонентами появился тонкий беловатый диск преципитации.

В ветеринарных лабораториях часто исследуют на сибирскую язву в РП кожевенно-меховое сырье. В лабораторию доставляют пробы кожевенного сырья в виде небольших квадратиков (или кружков), взятых от шкур в местах, вырез которых не снижает товарной ценности. Эти пробы нанизывают на тонкую проволо­ку в том порядке, в котором шкуры расположены на складе. Поступившие пробы обязательно стерилизуют автоклавированием при 1,5 атм 30 мин. Затем пробы измельчают и берут навески: 1 г — от парного, мороженого, пресно-сухого и сухосоленого сы­рья и 2 г — от мокросоленого. Пробы заливают экстрагирующей жидкостью (физиологический раствор, содержащий 0,3 % крис­таллического фенола).

Пробы сырья от всех видов животных экстрагируют холодным способом при комнатной температуре в течение 16...20 ч; пробы от свиных шкур кипятят 30 мин. Экстракты фильтруют через ас­бестовую вату до прозрачности (предварительно взболтав содер­жимое баночек с пробами). Компоненты соединяют методом «наслаивания» или «подслаивания».

Контроли РП. 1. Контроль преципитирующей сыворотки: а) со стандартным сибиреязвенным антигеном (результат поло­жительный в течение 1...2 мин); б) с экстрактом из заведомо бла­гополучных боенских кож (результат отрицательный в течение 1 ч); в) с экстрагирующей жидкостью (результат отрицательный в течение 1ч). 2. Контроль асбестовой ваты на нейтральность (при поступлении каждой новой партии асбестовой ваты).

Учет результатов РП проводят через 10... 15 мин для пресно-сухого (одиночные пробы), через 30 мин — для пресно-сухого (сдвоенные пробы) и сухосоленого (одиночные пробы), через 60 мин — для сухосоленого (сдвоенные пробы) и мокросоленого сырья.

При исследовании на сибирскую язву свежего тканевого мате­риала, а также при идентификации выделенных культур можно использовать реакцию диск-преципитации, которая основана на взаимодействии продуктов метаболизма возбудителя (антиген), растущего в жидкой питательной среде, с антителами преципи­тирующей сибиреязвенной сыворотки.

В стерильную бактериологическую пробирку вносят 0,5...1 мл преципитирующей сибиреязвенной сыворотки, на ее поверх­ность осторожно (по стенке пробирки) наслаивают расплавлен­ный (45...50°С) 1%-й агаровый гель столбиком высотой 5...7 мм. Далее на поверхность застывшего агара наливают 1... 1,5 мл жид­кой питательной среды (МПБ, среда ГКИ и т. д.) и в нее делают посев исследуемого тканевого материала или идентифицируемой культуры микроорганизма.

Посевы выдерживают при 37...38 °С 16...20 ч. Результаты учи­тывают, просматривая пробирку в проходящем свете на черном фоне. В положительном случае в средней части столбика агаро­вого геля обнаруживают тонкую белую четкую линию (диск) пре­ципитации. Сапрофитные бациллы при росте в этой системе преципитации не дают. Некоторые штаммы В. cereus могут вызы­вать в нижней части агарового столбика образование рыхлой тол­стой зоны преципитации, которая за 30...40 ч разрыхляется и сливается с преципитирующей сывороткой.

Биопрепараты. Вакцина СТИ — живая вакцина из эталонного штамма, полученного Н. Н. Гинсбургом (1944), представляет со­бой споровую (95... 100 %) агаровую культуру в виде суспензии в 30%-м стерильном растворе глицерина; содержит (2,5...3,5)*10⁷ жизнеспособных спор в 1 мл. Вакцину контролируют на чистоту роста, концентрацию спор, безвредность на кроликах, иммуногенность на морских свинках.

Вакцина ГНКИ — сухая живая вакцина из эталонного штамма ГНКИ. Содержит 5 • 10⁷ спор в 1 мл. Готовят и контролируют так же, как вакцину СТИ. Срок годности сухой вакцины 3 года.

Вакцина против сибирской язвы из штамма № 55.

Ассоциированная живая жидкая вакцина против сибирской язвы и эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота.

Лечебно-профилактическую сибиреязвенную сыворотку по­лучают гипериммунизацией лошадей инактивированной сиби­реязвенной культурой. Сыворотку проверяют на стерильность, безвредность на белых мышах и морских свинках, активность на кроликах. Также выпускают противосибиреязвенный глобу­лин.

Сибиреязвенная преципитирующая сыворотка предназначе­на для исследования материала на сибирскую язву в реакции преципитации. Сыворотку получают гипериммунизацией лоша­дей.

Сибиреязвенный стандартный антиген для РП выпускают для контроля активности преципитирующей сыворотки. Представля­ет собой экстракт из инактивированной бактериальной массы В. anthracis.

Сибиреязвенные люминесцирующие сыворотки готовят из сибиреязвенной преципитирующей сыворотки; предназначены для ускоренного обнаружения некапсулированных клеток возбу­дителя в первичных посевах.

Сибиреязвенные диагностические бактериофаги представля­ют собой освобожденную от бактерий путем фильтрования жид­кость бульонной культуры возбудителя, зараженную бактериофа­гом. Титр бактериофага 10.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Изучить и описать морфологические, тинкториальные и культуральные свойства В. anthracis.

2. Освоить технику постановки РП для исследования тканево­го и кожевенно-мехового сырья на сибирскую язву.

3. Ознакомиться с феноменом «ожерелья» и сибиреязвенными биопрепаратами.

Контрольные вопросы

1. Каковы правила взятия патологического материала?

2. Какие методы применяют для бактериологической диагностики сибирской язвы?

3. Каковы морфологические, тинкториальные и культуральные свойства

B. anthracis?

4. На чем основана дифференциация В.anthracis от сапрофитных спорообразую-щих аэробов?

5. Как идентифицируют возбудитель сибирской язвы при помощи сибиреяз­венного бактериофага?

6. Что такое феномен «ожерелья»?

7. Какие серологические методы применяют для обнаружения сибиреязвенного антигена в исследуемом материале?