61. Регуляция транскрипции у прокариот.
Единица транскрипции прокариот – оперон, состоит из 1) промотора – места первичного прикрепления РНК-полимеразы, 2) оператора – включает и выключает экспрессию структурных генов 3) структурных генов. На некотором расстоянии от оперона находится ген-регулятор, отвечающий за синтез белка-репрессора, способного вступать в химическое взаимодействие с геном-оператором и «выключать» его работу.
Поступление в кл индуктора индуктор+белок-репрессор освобождение гена-оператора РНК-полимераза присоединяется к промотору комплементарно со структурных генов создается и-РНК трансляция и-РНК синтез фермента, разрушающего индуктор освобождение белка-репрессора присоединение его к оператору остановка трансляции.
65,67. ПЦР – увеличение количества копий ДНК, находящейся в биологическом материале в минимальных количествах. Этапы: 1) денатурация ДНК (до 90) 2) добавление специфического праймера и охлаждение ДНК (до 55) (отжиг) 3) добавление нуклеотидов (субстратов синтеза) и ДНК-полимеразы (фермента синтеза) 4) повторение цикла. Позволяет за короткое время получить множество копий ДНК (порядка 20 млн за 0,5 ч).
Применение: 1) диагностика вирусных и бактериальных инфекций (ВИЧ, гепатит, хламидиоз) 2) генетическая диагностика заболеваний 3) судебная медицина.
66. Расшифровав нуклеотидную последовательность гена, можно установить последовательность АК в кодируемом белке, однако следует помнить что ген содержит некодирующие последовательности – интроны и спейсеры, которые удаляются в ходе процессинга и сплайсинга и не отражаются в структуре конечного белка. Поэтому, чтобы достоверно установить последовательность АК в белке, можно методами генетической инженерии синтезировать белок, а затем подвергнуть его биохимическому анализу (электрофорезу).
68. Клонирование – получение большого количества молекул, клеток, организмов – потомков одного предка. Для клонирования бактериальных и вирусных генов необходимы носители генетической информации – плазмиды, ДНК (РНК) бактериофага, нуклеоид, хромосомы дрожжей.
Этапы: 1) получение генетического материала 2) включение гена в векторную молекулу, создание рекомбинантной ДНК 3) введение рекДНК в кл хозяина 4) отбор трансформированных кл на селективных средах.
Применение: 1) получение разнообразных вакцин и иммунологических диагностикумов 2) синтез ряда БАВ: СТ, инсулин, эритропоэтин, интерфероны, факторы свертывания крови 3) получение ферментов в промышленности 4) получение относительно недорогого пищевого белка для животных и т.д.
69. Вектор – природный ген определенного микроорганизма с внедренным в него участком чужеродного гена. В качестве векторов применяется: 1) плазмида – небольшая кольцевидная молекула ДНК бактерий, реплицируемая независимо от нуклеоида 2) бактериофаг лямбда 3) хромосомы дрожжей 4) космидные векторы - гибрид фага лямбда и плазмиды.
70. «Метод отпечатков пальцев» ДНК используется для: 1) идентификации личности в судебной медицине 2) комплексной диагностики наследственных заболеваний 3) поиске участков ДНК, отвечающих за развитие патологии 4) установления отцовства.
В основе метода – принцип гибридизации на основе комплементарности.
71. Рестриктазы (рестриктационные эндонуклеазы) – ферменты, узнающие специфическую последовательность нуклеотидов и разрывающие в этом месте молекулу ДНК. Действуют в области палиндромов ДНК – мест, где последовательность нуклеотидов одной цепи идентична последовательности нуклеотидов другой цепи, прочитанной в обратном порядке. В молекулярной биологии рестриктазы используют для создания генетических векторов (внедрение гена в плазмиду и т.п.)
72. При проведении блот-анализа ДНК используют одноцепочечную молекулу ДНК, комплементарную искомой и меченую радиоактивным фосфором P32. Позволяет диагностировать в геноме дефектные гены, установить наличие наследственных заболеваний.
73. Этапы постановки блот-анализа ДНК:
1) экстракция ДНК
2) разрезание ДНК рестриктазами
3) разделение ДНК путем электрофореза в агарозном геле
4) перенос ДНК на нитроцеллюлозу и денатурация ее щелочью
5) блокирование пустых зон избытком ДНК
6) обработка зондом и образование гибридов мишень-зонд
7) отмывка несвязанного зонда и ауторадиография