3.3.Кинетика простых ферментативных реакций с одним и двумя субстратами

В настоящем разделе мы попытаемся вывести математиче­ские выражения, характеризующие скорости катализируемых ферментами реакций. Естественно, важнейшим критерием пра­вильности такого выражения будет соответствие вычислен­ных и экспериментально найденных скоростей. Чтобы исклю­чить возможные недоразумения, сначала мы в общих чертах опишем некоторые экспериментальные методы определения ско­ростей реакций.

Прежде всего определим, что мы имеем в виду под ско­ростью реакции. Рассмотрим реакцию

Скорость этой реакции в приближении квазиравновесного со­стояния (раздел 3.2.1) определяется как

где символами sup обозначены молярные концентрации ис­ходного вещества S и продукта реакции Р соответственно. От­сюда следует, что v выражается в числе молей в единице объе­ма в единицу времени. Скорость реакции является интенсивной величиной, имеющей определенное значение в каждой точке реакционной смеси. Поэтому, если концентрации или другие интенсивные переменные изменяются от точки к точке, то и скорости реакции в этих точках будут различными. При экспе­риментальном изучении кинетики часто используют реакторы с эффективным перемешиванием, в которых обеспечивается од­на и та же скорость реакции во всем объеме реакционной смеси.

Как и при моделировании любых других технологических процессов, слово «точка» в определении скорости реакции используется не в строго геометрическом смысле. Напротив, здесь под точкой подразумевается некоторый объем, в который вхо­дит множество молекул, но который тем не менее очень мал по сравнению с объемом всей реакционной смеси. Это на пер­вый взгляд не столь существенное уточнение очень важно не забывать при переходе от гипотетических моделей к конкрет­ным биологическим системам. Например, при моделировании молекулярных процессов в отдельной изолированной клетке понятия о концентрации данного вещества Ai и скорости его превращения в определенной точке могут оказаться вообще не­применимыми, если в клетке содержится только небольшое чис­ло молекул А_ь К этому вопросу мы вернемся \ позднее, при изучении кинетики роста клетки (гл. 7).

Типичный эксперимент по изучению кинетики ферментатив­ных реакций (т. е. реакций, катализируемых ферментами) обычно проводят следующим образом. В нулевой момент вре­мени растворы субстрата и соответствующего очищенного фер­мента смешивают при эффективном перемешивании в закрытом сосуде, в котором поддерживается постоянная температура и который содержит буферный раствор, необходимый для под­держания определенного значения рН. Далее через заданные промежутки времени определяют концентрации субстрата и (или) продукта реакции. Для этой цели применяют различ­ные методы, в том числе спектрофотометрические, манометри­ческие, электродные, поляриметрические, а также методы, свя­занные с отбором проб. Обычно используют только данные о начальных скоростях реакций. Поскольку условия реакции, в том числе концентрации фермента и субстрата, точнее всего известны при нулевом времени реакции, начальный наклон кривой, отражающей изменение концентрации субстрата или продукта реакции в зависимости от времени, определяется по следующим данным:

На рис. 3.5 приведены данные, полученные в одном из экспе­риментов описанного типа. Обратите внимание на то, что при / = 0 в смеси уже имеется некоторое количество продукта реак­ции; отсюда следует, что нулевое время на самом деле не яв­ляется временем начала реакции. В этом заключается одна из трудностей, присущих методу определения начальных скорос­тей реакций; другие недостатки метода описаны в специальной литературе по химической кинетике. Тем не менее метод на­чальных скоростей позволяет с достаточной воспроизводи­мостью определять ферментативную активность и концентрации веществ в первый момент реакции и поэтому с успехом может i применяться в практической работе.

Jt- " Проблема воспроизводимости результатов определения фер-§g- ментативной активности важна со многих точек зрения, в том Щ' числе и с точки зрения конструкций реакторов, в которых осу­ществляются процессы с изолированными ферментами. В пре­дыдущих разделах мы уже упоминали, что белки в условиях,

отличающихся от свойственного им биологического окружения, легко подвергаются денатурации; в этой связи неудивительно^, Что изолированный фермент в «необычной» для него водной среде может постепенно терять свою каталитическую актив­ность (рис. 3.6). Известно, что такая инактивация характерна для многих ферментов; в то же время во многих руководствах по кинетике ферментативного катализа это явление в лучшем случае только упоминается. Проблема постепенной потери ка­талитической активности ферментами ие столь существенна in vivo (в интактном живом организме), когда снижение концент­раций ферментов за счет инактивации компенсируется их био­синтезом в необходимых количествах. Напротив, инактивацию фермента in vitro (вне живой клетки) необходимо учитывать как при изучении кинетики реакций, так и при проектировании ферментативных реакторов. К этой теме мы обратимся еще раз в разд. 3.7.

В подписи к рис. 3.5 (в скобках) нам впервые встречается другая типичная для кинетики ферментативного катализа осо­бенность. Обратите внимание на то, что количество фермента, использовавшегося в этом эксперименте, выражено в неких

«единицах». Что это за таинственные единицы и почему нельзя количество фермента выразить более понятным и более опре­деленным способом, например в молях или в единицах массы?

Сначала ответим на вторую часть вопроса. Количество фер­мента обычно не выражают, например, в единицах массы, по­скольку ферментные препараты, как правило, представляют собой смесь различных белков, в которой данный фермент яв­ляется всего лишь одним из нескольких компонентов. Содержа­ние интересующего нас фермента в этой смеси часто неизвест­но; более того, оно может быть различным в разных партиях препарата. Чтобы охарактеризовать препарат, содержание фер­мента обычно выражают в единицах каталитической активно­сти, содержащейся в единице массы ферментного препарата.

Единицей или единицей активности называют количество фермента, которое обладает определенной каталитической ак­тивностью в заданных для этого фермента стандартных усло­виях. Например, в эксперименте по гидролизу крахмала, ре­зультаты которого приведены на рис. 3.5, за единицу активно­сти глюкоамилазы принимали количество фермента, которое в 4%-ном растворе крахмала Линтнера при рН 4,5 и температу­ре 60 °С образует 1 мкмоль глюкозы в 1 мин. Отсюда следу­ет, что единица активности каждого конкретного фермента бу­дет иметь свое специфическое определение и, более того, один фермент может иметь несколько определений активности в за­висимости от конкретных условий катализируемых им реакций, л; Поэтому во избежание ошибок при интерпретации или использовании результатов изучения кинетики реакций ферментатив-'% ного катализа всегда следует тщательно проверять применяемое ^ в каждом случае определение единицы ферментативной актив-ности. Конечно, вероятность ошибки резко снижается, если известна активность высокоочищенного фермента.