3. Фермениты (энзимы) и их каталитическая активность.

3.1. Общие представления о ферментах как катализаторах

В клетке имеется мно­жество химических соединений. Как они синтезируются и вза­имодействуют друг с другом с достаточно высокими скоростями при относительно низких температурах и давлениях? Как клет­ка делает свой выбор, какие именно вещества следует в данный момент ввести в реакцию, а какие молекулы подвергнуть де­градации? Ответ на оба этих вопроса один — все реакции в клетке осуществляются и регулируются путем ферментативно­го катализа; ферменты же, как мы уже знаем, представляют собой глобулярные белки.

Поворотным пунктом в развитии энзимологии был 1897 г., когда Бухнер впервые выделил активные ферменты из живых клеток. Эта работа имела большое значение с двух точек зре­ния. Во-первых, было показано, что работающие в живом ор­ганизме катализаторы могут функционировать совершенно не­зависимо от любого другого клеточного процесса; как мы уви­дим в следующей главе, изолированные ферменты в настоящее время находят самое широкое применение. Во-вторых, откры­тие Бухнера стимулировало работы по выделению и очистке индивидуальных ферментов. В чистом виде один из ферментов впервые был выделен Самнером в 1926 г. Его изучение показа­ло, что он является белком; сейчас известно, что все ферменты представляют собой белки.

После основополагающих работ Самнера число известных ферментов постоянно возрастало и в настоящее время уже намного превысило 1500. Судя по количеству генетической ин­формации, заложенной даже в таких простых организмах, как Е, coti, можно уверенно предсказать, что в будущем будет идентифицировано и охарактеризовано множество новых фер­ментов. Действительно, единственная молекула ДНК, состав­ляющая хромосому Е. coti, несет в себе информацию, достаточ­ную для кодирования структур от 3000 до 4500 различных бел­ков.

Поскольку в этой главе и позднее мы будем упоминать ряд конкретных ферментов, здесь уместно сказать несколько слов об их номенклатуре. К сожалению, не существует общих правил номенклатуры, применимых ко всем ферментам. В подав­ляющем большинстве случаев в названии фермента отражается его функция, а не строение; обычно к названию субстрата до­бавляют суффикс -аза (например, уреазой называют фермент, катализирующий разложение мочевины). Иногда тот же суф­фикс добавляется к названию реакции, которую катализирует данный фермент (алкогольдегидрогеназа, например, катализи­рует окислительное дегидрирование спирта). Исключения из этого правила представляют исторически сложившиеся назва­ния ферментов (как правило, давно известных); сюда относят­ся пепсин и трипсин из пищеварительного тракта человека, используемый в сыроделии реннин и «старый желтый» фермент, вызывающий появление коричневой окраски на срезах яблок.

Ферменты катализируют реакции шести основных типов, ко­торые лежат в основе системы, рекомендованной Комиссией по ферментам (КФ), классификации и условного цифрового обоз­начения всех ферментов (табл. 3.1). Эта «официальная» систе­ма позволяет выразить в табличной форме и классифицировать выполняемые ферментами разнообразные функции, хотя наря­ду с ней до сих пор широко используется и прежняя более тра­диционная номенклатура ферментов.

Во избежание недоразумений давайте вспомним, что такое катализатор вообще. Катализатором называют вещество, ко­торое повышает скорость химической реакции, не претерпевая при этом необратимых химических изменений. Повышая ско­рость химической реакции, катализатор в то же время не на­рушает равновесия реакции (рис. 3.1). Равновесные концент­рации можно вычислить на основе одних лишь термодинами­ческих свойств субстратов (напомним, что субстратом в био­химии называют вещество, вступающее в катализируемую ферментом реакцию) и продуктов реакции. Кинетика реакции, однако, зависит от молекулярной динамики, и в настоящее вре­мя ее невозможно достаточно точно предсказать, не распола­гая экспериментальными данными.

Для изучения какой-либо реакции и разработки соответст­вующего технологического процесса необходимо располагать математическим выражением, определяющим скорость реакции (т. е. число молей вещества, реагирующего в единицу времени в единице объема) в зависимости от состава, температуры, дав­ления и других параметров реакционной смеси. Если вы ранее изучали каталитические реакции, то вам должны быть извест­ны общие принципы вывода выражений, характеризующих скорость реакций. Обычно прежде всего высказываются доста­точно обоснованные соображения относительно элементарных реакций, происходящих на молекулярном уровне. Затем с при­влечением некоторых приближений, затрагивающих динамику

одного или нескольких реакционноспособных промежуточных соединений, и с использованием ряда простых математических преобразований находят выражение для скорости суммарной реакции. В настоящей главе мы воспользуемся точно таким же подходом для оценки скоростей катализируемых ферментами реакций.

Аналогия между синтетическими катализаторами и фер­ментами не заканчивается на принципах моделирования кине­тики реакций. Математические выражения, определяющие ско­рости реакций, катализируемых этими двумя типами катализа­торов, очень близки, а иногда даже идентичны. Это объясня­ется тем, что в обоих случаях, как известно, в качестве промежуточного соединения образуется тот или иной комплекс реаги­рующего вещества (субстрата) с катализатором; общий механизм каталитических процессов, естественно, приводит к одинаковым выражениям для их скоростей. Позднее мы еще раз вкратце остановимся на этом вопросе.

В то же время важно не забывать и о существенных разли­чиях между синтетическими катализаторами и ферментами; о некоторых из таких различий мы уже упоминали. Подавляю­щее большинство синтетических катализаторов неспецифично в том смысле, что они могут катализировать аналогичные ре­акции с участием самых разнообразных реагентов. Некоторые ферменты также не отличаются высокой специфичностью, но многие катализируют только одно превращение крайне ограни­ченного числа субстратов. Обычно степень специфичности фер­мента соответствует его биологической функции. Высокая спе­цифичность нежелательна, например, для фермента, основная задача которого заключается в гидролизе белков до небольших пептидов и аминокислот. Напротив, фермент, катализирующий изомеризацию одного конкретного соединения, должен быть в высшей степени специфичным. Как уже упоминалось выше в разд. 2.2.4, считается, что специфичность фермента обусловлена его сложной объемной структурой, позволяющей сформировать ответственный за каталитические свойства фермента активный центр.

Другой отличительной чертой многих ферментов является наличие кофакторов, необходимых для проявления фермента­тивной активности. Кофактором называют соединение небелко­вой природы, которое связывается с неактивным белком (апо-ферментом) с образованием каталитически активного комплек­са. Последний биохимики часто называют голоферментом, мы же чаще будем называть его просто ферментом. Существует два различных типа кофакторов. Простейшими кофакторами являются ионы металлов (табл. 3.2). Роль кофакторов могут выполнять и сложные органические соединения, называемые коферментами. В предыдущей главе мы уже упоминали кофер-менты NAD, FAD и кофермент А(СоА); иногда кофактором может быть и АТР. Часто кофакторы связываются с фермента­ми довольно слабыми связями; в таких случаях существует равновесие между ферментом, апоферментом и кофактором. Вообще говоря, и прочно связанные с ферментом небелковые элементы структуры также являются коферментами, как, на­пример, гем в цитохроме с. Однако, как мы уже упоминали, ча­ще такие необратимо связанные группы называют простетичес-кими.

Приведенные в табл. 3.2 данные интересны и с той точки зрения, что здесь содержатся сведения, к которым мы будем неоднократно возвращаться при изучении процессов выделения и применения ферментов. Обратите внимание на то, что рядом с названиями некоторых ферментов указаны источники их вы­деления; например, глюкозоизомераза из бактерии Bacillus coagutans проявляет максимальную активность в присутствии кобальтового кофактора. Для того чтобы точно определить, о каком ферменте идет речь, во многих случаях необходи-

мо указывать и его происхождение. Дело в том, что другие организмы также синтезируют ферменты, катализирующие изомеризацию глюкозы во, фруктозу, и поэтому их тоже назы­вают глюкозоизомеразами. В то же время ферменты с одина­ковыми названиями, но выделенные из разных организмов, час­то имеют различные аминокислотные последовательности и по этой причине различаются по свойствам и каталитической ак­тивности. Например, для глюкозоизомеразы из В. coagulans необходим ион Со²⁺, а глюкозоизомераза из мутантного штам­ма того же организма при рН>8 активна и в отсутствие ко­бальта. Надо иметь всегда, в виду, что одно лишь название фермента ничего не говорит о природе какого-либо конкретно­го белка с определенными свойствами и соответствующими тех­нологическими требованиями. Чтобы устранить возможность двусмысленного толкования, нужно указать полное название продуцирующего этот фермент организма.

Как синтетические, так и биологические катализаторы в ходе выполнения своей каталитической функции постепенно утрачивают активность, однако ферменты в общем случае го­раздо более недолговечны. Сложная и запутанная пространст­венная структура ферментов, обусловливающая их необычно

Таблица 3.3.

высокие специфичность и активность, легко нарушается, что приводит к потере ферментом его каталитических свойств. Раз­личные пути инактивации ферментов и кинетика этих процес­сов будут рассмотрены позднее.

Часто утверждают, что ферменты более активны в том смысле, что они повышают скорость реакций в большей степе­ни, чем небиологические катализаторы. Степень активности ка­тализатора обычно выражают числом оборотов, которое представляет собой число молекул субстрата, реагирующих с актив-ным центром катализатора в единицу времени. Для сравнения в табл. 3.3 приведены параметры ряда реакций, катализируе­мых ферментами и синтетическими катализаторами. Оказыва­ется, что в диапазоне температур, в котором ферменты наибо­лее активны, они действительно повышают скорость реакций в-болыпей степени, чем большинство синтетических катализато­ров. При более высоких температурах, однако, активность ис­кусственных катализаторов обычно превосходит активность-ферментов. К сожалению, ферментативная активность не мо­жет бесконечно возрастать при повышении температуры; на­против, ферменты обычно теряют свою активность уже пр» сравнительно низких температурах, часто лишь на несколько-градусов превышающих температуру живой клетки.

Характерной особенностью ферментативного катализа явля­ется возможность его регуляции с помощью соединений не­большой молекулярной массы. Некоторые ферменты «выключа­ются» в присутствии определенных веществ; последними часто оказываются конечные продукты последовательности реакций,, в которой участвует регулируемый фермент. Эта особенность ферментов играет большую роль в нормальном жизненном цик­ле клетки. Некоторые аспекты кинетики ферментативных реак­ций такого типа мы изучим позднее и узнаем, как посредством изменения нормальных каналов регуляции внутриклеточных реакций можно резко повысить эффектив­ность промышленных биологических процессов.

Прежде чем приступить к моделированию кинетики фермен­тативного катализа, мы рассмотрим имеющиеся эксперимен­тальные данные о характере молекулярных превращений, ко­торые действительно происходят в процессе катализируемых ферментами реакций. На этой основе мы сможем высказать обоснованные гипотезы о последовательности элементарных, реакций и затем применить эти гипотезы для вывода матема­тических выражений, характеризующих скорость реакций.

3.2.Фермент-субстратные комплексы и механизм действия ферментов

В настоящее время не существует единой теории, объясня­ющей необычно высокую специфичность и активность фермент­ных катализаторов. В то же время в отношении небольшого-числа конкретных ферментов был выдвинут целый ряд вполне вероятных гипотез, подтвержденных экспериментальными дан­ными. По-видимому, положенные в основу этих гипотез явле­ния в совокупности и обусловливают специфические свойства ферментов. В настоящем разделе мы вкратце рассмотрим некоторые из этих гипотез; более подробные сведения читатель сможет найти в литературе, приведенной в конце главы. По­скольку все рассматриваемые здесь гипотезы только частично объясняют механизм действия ферментов, мы не будем пытать­ся обобщить эти данные с целью создания единой теории фер­ментативной активности.

Существование фермент-субстратных комплексов доказано -с помощью различных экспериментальных методов, в том чис­ле рентгеноструктурного анализа, спектроскопических методов и электронного парамагнитного резонанса. Субстрат связыва­ется с ферментом в определенной области молекулы фермента, называемой активным центром, где осуществляется катализируемая! ферментом реакция и образуются ее продукты. В свя­зывании субстрата с ферментом и образовании комплекса иног-.да принимают участие слабые взаимодействия, а в некоторых случаях при этом образуются и ковалентные связи. Комплекс образуется тогда, когда субстратный «ключ» входит в ферментный «замок». На рис. 3.2 особенно отчетливо видно, что фермент-субстратный комплекс образуется с помощью водородных связей между субстратом и группами, рас­положенными в самых разных участках аминокислотной последовательности фермента.

Этот пример также наглядно иллюстрирует понятие об активном центре. Молекула белка сложена таким образом, что реакционноспособные группы в боковых цепях нескольких аминокислотных остатков фермента образуют в высшей степени специфичную, пространственно организованную конструкцию, точно отвечающую конфигурации субстрата. В состав активных центров ферментов входят боковые цепи остатков Asp, Cys, Glu, His, Lys, Met, Ser, Thr, а также концевые аминные и карбоксильные группы. Поскольку в среднем возле субстрата расположено около 20 таких групп (значительно меньше, чем •общее число аминокислотных остатков в молекуле фермента), принято считать, что непосредственное участие в функциониро­вании активного центра фермента принимает только его небольшая часть. У больших ферментов может быть несколько активных центров. Большинство аминокислотных остатков, не входящих в активный центр, определяют характер складывания полипептидной цепи (вторичную структуру) и пространственное расположение одной части цепи относительно другой (третич­ную структуру), в результате чего и создается активный центр фермента (рис. 3.4).

Хотя ряд изложенных ниже более детальных гипотез все еще не лишен некоторых противоречий, следует подчеркнуть, что понятия об активном центре и фермент-субстратном комп-

лексе в настоящее время общеприняты и лежат в основе боль­шинства теорий, объясняющих механизм действия ферментов. В дальнейшем мы также будем пользоваться этими понятиями при математическом анализе кинетики ферментативного ката­лиза.

Два различных подхода к объяснению ферментативной ак­тивности схематически отображены на рис. 3.3. Фермент может связывать молекулы двух субстратов таким образом, что реак-

ционноспособные группы последних будут располагаться поблизости друг от друга и от каталитических групп фермента. Это, естественно, будет способствовать ускорению химической реакции; такой эффект известен под названием эффекта сближения. Предположим далее, что молекулы двух субстратов не обладают сферической симметрией. В этом случае реакция произойдет только в том случае, когда при сближении молекулы располагаются в ориентации, обеспечивающей тесное взаимодействие реакционноспособных атомов или групп. Считается, что ферменты связывают молекулы субстратов, так что по­следние занимают особенно благоприятное положение, создавая таким образом эффект ориентации, который и обеспечивает ускорение реакции. Это явление, иногда называемое также орбитальным управлением, вносит свой вклад в процесс ферментативного катализа, однако количественную величину соответствующего эффекта в общем случае пока еще определить трудно.

Прежде чем приступить к краткому обзору химии ферментативного катализа, следует упомянуть еще одну гипотезу, связанную с геометрией фермента. Известно, что связывание субстрата сопровождается небольшим изменением пространственной структуры некоторых ферментов. В частности, путем изучения трехмерной структуры ферментов лизоцима и карбоксипепти-дазы А в виде комплексов с субстратами и без субстратов бы­ло показано, что конформации ферментов при связывании субстрата несколько изменяются. Такое индуцированное соответствие фермента и субстрата может вносить свой вклад в процесс ферментативного катализа. Предлагались также усложненные варианты модели индуцированного соответствия, в которых в ходе процесса последовательно образуется несколько промежуточных фермент-субстратных комплексов. Некоторая эластичность и гибкость молекулы фермента может способствовать тщательной пространственной подгонке его каталитических групп и тем самым ускорению превращений каждого из проме­жуточных соединений. Возможно, что индуцирование субстратом изменений в конформации активного центра характерно для ферментативного катализа вообще, хотя эксперименталь­ное обнаружение этого эффекта связано с рядом трудностей и поэтому было осуществлено только в случае нескольких ферментов.

Некоторые ферменты осуществляют реакции, хорошо извест­ные химику-органику. Одной из таких реакций является общий кислотно-основной катализ, в котором катализатор на одной из стадий процесса захватывает или отдает протон. Этот тип катализа, в частности, лежит в основе механизма действия од­ного из немногих ферментов, для которых предложена доста­точно убедительная полная последовательность элементарных стадий каталитического процесса (рис. 3.4). Выделяемый из поджелудочной железы химотрипсин представляет собой про-теолитический (т. е. гидролизующий белки) фермент, специ­фично расщепляющий пептидные связи, образованные карбок­сильными группами остатков тирозина, триптофана и фенила-ланина. Считается, что в реакции химотрипсинового катализа как при отщеплении, так и при присоединении протонов роль переносчика последних играет вода. В сущности, к общему кислотно-основному катализу можно свести целый ряд очень важных в химии клетки реакций, в том числе процессы присо­единения к карбонильным соединениям и гидролиз сложных эфиров.

В ферментативном катализе важную роль могут играть и другие факторы, например ковалентный катализ, деформация связей, электростатический катализ, многофункциональный ка­тализ и эффекты растворителя (вспомните структуру масляной капли, приведенную в предыдущей главе). Детальное описание этих эффектов можно найти в приведенной в конце главы ли-

тературе; вероятно, они, как и рассмотренные в настоящем раз­деле факторы, могут оказывать влияние на некоторые катали­зируемые ферментами реакции. Поскольку в общем случае ре­акции ферментативного катализа включают в себя множество эффектов, неудивительно, что пока еще не удалось разработать простую общую схему, которая позволила бы оценить их сум­марное влияние и относительную значимость каждого из них. К счастью, математические выражения для скоростей катали­зируемых ферментами реакций можно вывести, опираясь лишь на основную концепцию о фермент-субстратном комплексе как основном промежуточном соединении.