1. Инициация

Активация промотора происходит с помощью белка ТАТА-фактора, который взаимодействует с ТАТА-боксом промотора. Присоединение белка облегчает взаимодействие промотора с РНК-полимеразой. Факторы инициации вызывают изменение конформации РНК-полимеразы и обеспечивают образование транскрипционной вилки, в которой матрица доступна для инициации синтеза цепи РНК. Далее синтезируется олигонуклеотид (8-10 остатков), ợ-субъединица отделяется от РНК-полимеразы, вместо нее присоединяются факторы элонгации.

2. Элонгация

Факторы элонгации повышают активность РНК-полимеразы и облегчают расхождение цепей ДНК. Растущий конец цепи РНК образует временную гибридную спираль с матричной цепью ДНК. По мере продвижения РНК-полимеразы по матрице впереди нее происходит расхождение, а сзади – восстановление двойной спирали ДНК.

3. Терминация

Синтез РНК завершается в сайтах терминации. Под воздействием фактора терминации происходит отделение РНК-полимеразы и пре-РНК от матрицы.

Ковалентная модификация (процессинг) мРНК:

• Модификация 5’-конца. На стадии элонгации, когда длина первичного транскрипта достигает 30 нуклеотидов, гуанилилтрансфераза кэпирует его 5’-конец. Фермент гидролезует макроэргическую связь молекулы ГТФ и присоединяет нуклеотиддифосфатный остаток 5’-фосфатной группой к 5’-концу фрагмента РНК с образованием 5’,5’-фосфодиэфирной связи. Последующее метилирование остатка гуанина в составе ГТФ с образованием N₇-метилгуанозина завершает формирование кэпа. Модифицированный конец обеспечивает инициацию трансляции, удлиняет время жизни мРНК, защищая ее от дейтсвия 5’-экзонуклеаз цитоплазмы. Наличие кэпа необходимо для работы ферментов, удаляющих интроны.

• Модификация 3’-конца. ПолиА-полимераза формирует полиА-последовательность, состоящую из 100-200 остатков адениловой кислоты. Сигналом к началу процесса служит появление последовательности -AAUAAA- на цепи РНК. Фермент разрывает 3’-фосфодиэфирную связь после появления данной последовательности. В точке разрыва наращивается полиА-хвост. Наличие полиА-хвоста облегчает выход мРНК из ядра и замедляет ее гидролиз в цитоплазме.

• Сплайсинг первичных транскриптов мРНК. мРНК цитоплазмы и ДНК не комплементарны. Последовательности ДНК, которые отсутствуют в зрелой мРНК – интроны, те, что присутствуют – экзоны. Сплайсинг – процесс вырезания интронов и сшивания экзонов. В результате из пре-мРНК получается зрелая мРНК. Происходит в ядре. Процесс вырезания интронов протекает при участии малых ядерных РНП, в которые входит мяРНК, связанная с белковым остовом из нескольких промотеров. На концах интронов имеются высокоспецифические последовательности AGGU (5’-конец) и GAGG (3’-конец) – сайты сплайсинга, которые обеспечивают их удаление из пре-мРНК.

мяРНП связываются с сайтами сплайсинга. Формируются сплайсосомы. Концы экзонов сближаются. Сплайсосома катализирует реакцию расщепления фосфодиэфирной связи на границе интрона с экзоном. Интрон удаляется, экзоны сшиваются.

Альтернативный сплайсинг: Экзоны и интроны разных вариантов сплайсинга могут различаться. В результате образуются разные мРНК с одного первичного транскрипта. Разные варианты сплайсинга могут приводить к образованию разных изоформ одного и того же белка.

Процессинг первичных транскриптов рРНК и тРНК

• Процессинг тРНК:

Первичный тРНК соержит 100 нуклеотидов, после процессинга – 90-70. Модификации происходят при участии РНК-аз. Одна из них действует по типу 3’=экзонуклеазы, отрезая по одному нуклеотиду, пока не достигнет последовательности –ССА. В некоторых случаях эта последовательность образуется путем присоединения. Так возникает акцепторный конец. Пре-тРНК содержит 1 интрон из 14-16 нуклеотидов. Удаление его приводит к образованию антикодона – триплета нуклеотидов, обеспечивающего взаимодействие тРНК с комплементарным кодоном мРНКв ходе синтеза белков.

• Процессинг рРНК:

Первичные транскрипты имеют длину 13000 нуклеотидных остатков (45s-рРНК). После процессинга образуются 28s рРНК, 18s рРНК, 5,8s рРНК, которые являются компонентами рибосом.

Биосинтез белков (трансляция)

Генетический код – способ кодирования последовательности аминокислот при помощи последовательности нуклеотидов.

Свойства генетического кода:

• Триплетность – кодирующими элементамив шифровании последовательности аминокислот являются триплеты нуклеотидов;

• Специфичность – каждому кодону соответствует одна аминокислота;

• Вырожденость – включение в белок одной и той же аминокислоты определяют несколько кодонов. Данное свойство повышает устойчитвость информационного потока к неблагоприятным воздействиям внешней и внутренней среды;

• Линейность записи информации – в ходе трансляции мРНК читаются с фиксированной стартовой точки и не прерываются;

• Универсальность – смысл кода одинаков для всех живых организмов;

• Колинеарность гена и продукта – аминокислотная последовательность в белке колинеарна последовательности зрелой мРНК.

Основные компоненты белоксинтезирующей системы:

• Аминокислоты;

• мРНК – содержит информацию о структуре белка и используется как матрица;

• тРНК – обеспечивают включение аминокислот в белок. В процессе синтеза белка на рибосоме антикодон тРНК и кодон мРНК связываются по типу комплементарности. При этом третье основание кодонов имеет опр. Степень свободы при связывании с антикодоном – «гипотеза качания»;

• Аминоацил-тРНК синтетазы – катализируют образование в цитозоле фосфодиэфирных связей между акцепторными концами тРНК и аминокислотами. В активном центре ферментов есть4 участка для узнавания аминокислоты, тРНК, АТФ, Н₂О (участвует в гидрнолизе неправильных аминоациладенилатов). Каждый член семейства узнает только одну аминокислоту. Активация аминокислот происходит в 2 стадии: на первой аминокислота связывается с АТФ с образованием богатого энергией промежуточного соединения – аминоацил-АМФ. На второй стадии аминоацильный остаток, оставаясь связанным с ферментом, взаимодействует с тРНК с образованием аминоацил-тРНК. Аминокислоты присоединяются к 3’ – ОН гуппам рибозы на 3’-конце тРНК. Энергия, заключенная в макроэргической связи аминоацил-тРНК. Впоследствии идет на образование пептидной связи в ходе синтеза белка. Пирофосфат, выделяющийся в ходе реакции, расщепляется на 2 ортофосфата, что делает активацию аминокислот необратимой;

• Рибосомы – место сборки аминокислот в белки. Состоят из 2 субъедениц, каждая представлена рРНК и белковой частью. Малая субъединица присоединяет мРНК и декодирует информацию с помощью тРНК и механизма транслокации, большая ответственна за образование пептидных связей. В присутствии мРНК субъединицы объединяются с образованием полной рибосомы. В рибосоме есть 2 центра для присоединения тРНК: аминоацильный (А) и пептидильный (Р). Вместе они включают участок мРНК, равный 2 кодонам. А-центр связывает аа-тРНК, Р-центр связывает пептидил-тРНК, т.е. тРНК, связанную с пептидной цепочкой, которая уже синтезирована;

• Белковые факторы – стабилизируют или облегчают функционирование белоксинтезирующего аппарата;

• АТФ и ГТФ – источники энергии. На включение 1 аминокислоты в полипептидную цепь требуетсяэнергия 4 макроэргических связей: 2 из АТФ в ходе реакции, катализируемой аа-тРНК-синтетазой и 2 из ГТФ: одна – на связывание аа-тРНК в А-центре рибосомы, 1 – на стадию транслокации. Еще по одной АТФ и ГТФ затрачивается на инициацию и терминацию синтеза полипептидной цепи.

Синтез полипептидной цепи на рибосоме

В ходе синтеза белка прочтение информации мРНК идет от 5’- к 3’- концу, обеспечивая синтез пептида от N- к C- концу. Каждая мРНК кодирует строение только одной полипептидной цепи.

Этапы трансляции:

• Инициация – образование комплекса рибосомы и инициирующей метиониновой тРНК. В этом процессе участвуют 10 факторов инициации (eIF). Первоначально 40s субъединица соединяется с фактором инициации, который препятствует связыванию ее с другой субъединицей, но стимулирует связывание с тройным комплексом - инициирующей метиониновой тРНК, eIF2, ГТФ. Этот комплекс связывается с 5’ концом мРНК. Один из eIF присоединяется к кэпу на молекуле мРНК. Прикрепившись к мРНК, 40s субъединица скользит по некодирующей части мРНК до тех пор, пока не достигнет инициирующего кодона AUG. Скольжение сопровождается гидролизом АТФ, энергия которого затрачивается на преодоление участков спирализации в нетранслируемой части мРНК. Достигнув начала кодирующей последовательности, субъединица 40s связывается c субъединицей 60S за счет гидролиза ГТФ. При этом формируются А и Р центры рибосомы, в Р-центре оказывается AUG кодон с присоединенной к нему инициирующей метиониновой тРНК, а в А-центре – триплет, кодирующий включение первой аминокислоты синтезируемого белка;

• Элонгация – рибосома с помощью аа-тРНК последовательно читает мРНК в виде триплетов нуклеотидов, наращивая полипептидную цепочку за счет последовательного присоединения аминокислот. Включение каждой аминокислоты происходит в 3 стадии: 1. аа-тРНК каждой входящей в белок аминокислоты связывается с А-центром рибосомы: аа-тРНК взаимодействует с рибосомой в виде тройного коплекса, состоящего из фактора элонгации 1, аа-тРНК, ГТФ;

2.Пептид от пептидил-тРНК, находящейся в Р-центре, присоединяется к α-NH₂группе аминоацильного остатка аа-тРНК А-центра с образованием новой пептидной связи – реакция транспептидации. В ходе этой реакции остаток метионина инициирующей метиониновой тРНК связывается с α-аминогруппой аминокислоты, расположенной в А-центре;

3. Удлиненная на один аминокислотный остаток пептидил-тРНК перемещается из А-центра в Р-центр в результате транслокации рибосомы. К рибосоме присоединяется фактор элонгации 2 и за счет энергии ГТФ продвигает рибосому по мРНК на один кодон к 3’-концу. В результате дипептидил-тРНК перемещается из А-центра в Р-центр. Свободная от метионина инициирующая тРНК покидает рибосому, а в область центра попадает следующий кодон.

• Терминация – происходит, когда в А-центр рибосомы попадает один из стоп-кодонов: UAG, UAA или UGA. В этом случае вместо тРНК к рибосоме присоединяются 2 RF – фактора, или фактора терминации. Один из них с помощью пептидилтрансферазного центра катализирует каталитическое отщепление синтезированного пептида от тРНК. Другой за счет энергии гидролиза ГТФ вызывает диссоциацию рибосомы на субъединицы.

Посттрансляционные модификации полипептидной цепи:

• Частичный протеолиз - Удаление части полипептидно цепи, обуславливающее переход белка в активную форму;

• Ковалентные модификации – присоединение различных групп (фосфатных, ацильных, метильных, олигосахаридных и др.)

• Фолдинг полипептидных цепей – формирование ункальной третичной или четвертичной структуры.